李衛(wèi)東 顏源均 趙世橋 馮堯 蒲志強(qiáng) 馮飛

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由嗜心肌病毒感染心肌形成以心肌嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷為主的心臟疾病。常見(jiàn)病毒為柯薩奇病毒B組(coxsackie virus B，CVB)。病毒性心肌炎多發(fā)生于青少年，大部分病情較輕，能夠痊愈；但有少部分病情較重而導(dǎo)致患者死亡，還有一部分發(fā)展成為擴(kuò)張型心肌病。研究[1]報(bào)道，炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致病毒性心肌炎早期心肌細(xì)胞損傷的主要機(jī)制。在病毒性心肌炎炎癥反應(yīng)中，炎癥趨化因子IL-1β、IL-18在其中起到重要作用，IL-1β、IL-18在機(jī)體內(nèi)是以無(wú)功能的前體形式存在的，NLRP3能夠通過(guò)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)寡集半胱天冬蛋白酶的前體(procaspase-1)從而激活門冬氨酸特異的胱氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)，激活的caspase-1能對(duì)pro-IL-1β、pro-IL-18進(jìn)行加工切割，形成成熟的具有功能的IL-1β、IL-18并分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用[2]。因此，本研究探討核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性體在病毒感染早期心肌細(xì)胞的作用以及與心肌細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，為尋找病毒性心肌炎有效的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CVB3(Nancy株)購(gòu)于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。出生1～2 d的SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠由川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 抗NLRP3、ASC及HRP-結(jié)合次級(jí)產(chǎn)物的抗體，檢測(cè)IL-β、IL-18、CK-MB、cTnI等的ELISA試劑盒，瓊脂糖購(gòu)自BOSTER公司，胰蛋白酶購(gòu)于Hyclone，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液、annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，Lipofectamine 2000試劑購(gòu)于Invitrogen，NLRP3 siRNA購(gòu)于Santa。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)既往的文獻(xiàn)[3]報(bào)道采用差速貼壁方法分離培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞。于無(wú)菌條件下迅速獲取出乳鼠心臟，將獲取的心臟組織剪切成1～2 mm3的小塊組織并裝入含有約10 mL 0.1%胰蛋白酶的三角瓶中，反復(fù)消化后加入含血清的培養(yǎng)液終止消化，以4000 r/min離心約10 min，而后棄去上清液。于殘留的固體中加入含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中混勻。于37 ℃的含有5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁1.5～2 h，吸出含有未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液,于顯微鏡下計(jì)數(shù)完成后調(diào)整濃度為3×105/mL接種于含有5-溴脫氧尿苷(最終濃度為0.1 mol/L，抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng))與10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2培養(yǎng)箱中 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，顯微鏡下可觀察到85%的細(xì)胞為心肌細(xì)胞且具有明顯的搏動(dòng)。

1.2.2 NLRP3基因沉默及CVB3感染心肌細(xì)胞模型的建立 設(shè)計(jì)NLRP3的小干擾RNA(siRNA)以轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)好的SD大鼠心肌細(xì)胞中，具體的siRNA轉(zhuǎn)染操作參照美國(guó)Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑盒中推薦的轉(zhuǎn)染步驟，具體步驟如下：轉(zhuǎn)染前利用PBS將培養(yǎng)48 h的原代心臟細(xì)胞洗滌2次，以5×103細(xì)胞/孔接種于6孔板中。將siRNA溶液與lipofectamin2000溶液混合液1 mL/孔，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，孵育6 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后完成轉(zhuǎn)染。將CVB3 Nancy株接種在HeLa細(xì)胞上并測(cè)定50%組織感染率(50% tissue culture infective does，TCID50)，選100 TCID50感染心肌細(xì)胞。在心肌細(xì)胞NLRP3基因沉默后的第二天加入100 TCID5CVB3病毒液100 μL于37 ℃含有5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h更換為普通培養(yǎng)液，得到CVB3誘導(dǎo)的心肌炎心肌細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)包含4個(gè)組別，分別包括正常對(duì)照組、Scrambled-siRNA組、CVB3+Scrambled-siRNA組、CVB3+NLRP3-siRNA組。

1.2.3 ELISA檢測(cè)各組IL-1β、IL-18、CK-MB、cTnI的水平 各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞處理24 h后，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式，將樣品的OD值帶入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即得樣品實(shí)際濃度。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)各組中NLRP3的mRNA表達(dá) 嚴(yán)格按照RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。NLRP3 的上游引物序列為5′-ACGGCAAGTTCGA AAAAGGC-3′，下游引物序列為 5′-AGACCTCGG CAGAAGCTAGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為87 bp；β-actin 的上游引物序列為5′-AGACAGCCGCATCTTCTT GT-3′，下游引物序列為5′-TGATGGCAACAAT GTCCACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為142 bp。嚴(yán)格按照SYBR?Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)說(shuō)明書(shū)操作，整個(gè)過(guò)程中在加入ROX后需避光操作，冰上操作。由軟件記錄CT值，計(jì)算2-ΔΔCT值作為mRNA的表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組中NLRP3、caspase-1、IL-1β、cleaved caspase 1、cleaved caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-9、Bcl-2、bax的蛋白水平 各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞處理24 h后，按照說(shuō)明書(shū)提取各組總蛋白。采用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各處理組細(xì)胞中的總蛋白量，SDS-PAGE凝膠電泳(每孔上樣100 μg)，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加入抗NLRP3、caspase-1、IL-1β、cleaved caspase-1、cleaved caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-9、Bcl-2、bax抗體稀釋液(1∶400)、GAPDH內(nèi)參稀釋液(1∶1000)，4 ℃孵育過(guò)夜，第二天加入封閉液稀釋的Ⅱ抗(1∶4000)。充分漂洗后以ECL法顯像，將膜放入曝光儀中曝光，根據(jù)條帶顯色的強(qiáng)弱選擇曝光時(shí)間，Image J軟件統(tǒng)計(jì)各圖灰度值，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CVB3病毒感染心肌細(xì)胞中NLRP3基因及蛋白表達(dá)情況以及NLRP3基因沉默 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CVB3感染后NLRP3的mRNA表達(dá)量明顯升高在第12 h達(dá)到高峰，后其表達(dá)量稍有下降并趨于穩(wěn)定，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)量逐漸降低(圖1A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，CVB3感染后NLRP3的蛋白表達(dá)量明顯升高且24 h達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始降低，這與NLRP3的mRNA升高基本一致(圖1B)。在敲減NLRP3基因表達(dá)后，CVB3感染心肌細(xì)胞后RT-qPCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，敲減NLRP3基因的表達(dá)可以明顯降低病毒感染心肌細(xì)胞中NLRP3基因及蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖1C、D)，表明用基因沉默技術(shù)敲減NLRP3表達(dá)是成功的。

圖1 CVB3病毒感染心肌細(xì)胞NLRP3基因及蛋白表達(dá)的情況

2.2 敲減NLRP3基因的表達(dá)可一定程度減輕心肌細(xì)胞損傷 ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，CVB3+Scrambled-siRNA組明顯升高(P<0.01)，敲減NLRP3表達(dá)后，同CVB3+NLRP3-siRNA組比較，CK-MB、cTnI的表達(dá)均有不同程度降低(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 ELISA檢測(cè)各組中CK-MB、cTnI的水平

2.3 敲減NLRP3基因的表達(dá)對(duì)病毒感染心肌細(xì)胞中NLRP3下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18的影響 在心肌細(xì)胞感染CVB3病毒的6～24 h，caspase-1的蛋白表達(dá)量明顯增加，見(jiàn)圖3A。敲減乳鼠心肌細(xì)胞中NLRP3基因的表達(dá)后，cleaved caspase-1的蛋白水平明顯降低，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。與CVB3+Scrambled-siRNA組相比，敲減NLRP3基因的表達(dá)后IL-1β、IL-18的含量明顯下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3C、D。

同時(shí)采用Western blot檢測(cè)敲減NLRP3基因的表達(dá)后CVB3感染24 h IL-1β蛋白的變化，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比較，敲減NLRP3基因的表達(dá)后IL-1β的蛋白水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3E。與ELISA檢測(cè)結(jié)果一致。進(jìn)一步證明了抑制NLRP3的激活，可以抑制CVB3感染心肌細(xì)胞導(dǎo)致的IL-1β、IL-18的增加。

圖3 NLRP3基因沉默后其下游因子caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白水平的變化

2.4 敲減NLRP3基因的表達(dá)對(duì)病毒感染心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 正常對(duì)照組比較，CVB3+Scrambled-siRNA組的caspase-8表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但敲減NLRP3基因的表達(dá)后，與CVB3組比較caspase-8表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。與正常對(duì)照組相比，CVB3+Scrambled-siRNA組cleaved caspase-3的蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；敲減NLRP3基因的表達(dá)后，cleaved caspase-3的蛋白水平與CVB3+Scrambled-siRNA組比較明顯降低(P<0.05)；Western blot法檢測(cè)cleaved caspase-9的結(jié)果表明，CVB3+Scrambled-siRNA組的cleaved caspase -9明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)；敲減NLRP3基因的表達(dá)后，與CVB3+Scrambled-siRNA組相比較，cleavedcaspase-9的蛋白水平有所下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 各組心肌細(xì)胞中凋亡蛋白caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白水平的變化

2.5 敲減NLRP3基因的表達(dá)對(duì)CVB3病毒感染心肌細(xì)胞中Bcl-2、Bax的影響 Western blot檢測(cè)與線粒體凋亡途徑相關(guān)的Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)情況：與正常對(duì)照組相比，CVB3+Scrambled-siRNA組的Bcl-2蛋白表達(dá)量降低及Bax蛋白的表達(dá)明顯增加，Bax/Bcl-2比值增高(P<0.05)。敲減NLRP3基因的表達(dá)后，與CVB3+Scrambled-siRNA組對(duì)比， Bcl-2蛋白降低幅度減弱(P<0.05)；但對(duì)Bax蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)，Bax/Bcl-2比值一定程度降低(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)水平的變化

3 討論

病毒性心肌炎中最常見(jiàn)的病毒感染為CVB3病毒，其對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷主要包括炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞凋亡[3-4]。病毒感染心肌細(xì)胞后激活心肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥信號(hào)通路，產(chǎn)生IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等炎癥趨化因子募集炎癥細(xì)胞聚集產(chǎn)生炎癥反應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。

NLRP3是NLRP亞家族中的一員，NLRP亞家族包含有NLRP1、NLRP2、NLRP3等，廣泛存在于細(xì)胞漿中[5]。NLRP3炎性體除了存在于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞外，還存在于心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及心肌成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)中[6]。本課題組前期研究顯示，血管緊張素Ⅱ刺激體外培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞內(nèi)NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的mRNA及蛋白水平表達(dá)明顯升高，在細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中IL-1β的含量也升高[7]。抑制心肌細(xì)胞中NLRP3的激活可以減輕糖尿病大鼠心肌炎癥反應(yīng)及心肌細(xì)胞損傷[8]。病毒性心肌炎導(dǎo)致心肌細(xì)胞中NLRP3激活的機(jī)制包括病毒RNA介導(dǎo)的激活、細(xì)胞內(nèi)ROS介導(dǎo)的激活和病毒孔蛋白介導(dǎo)的激活等3方面[9-11]。本課題組在病毒性心肌炎動(dòng)物模型中研究顯示，在病毒感染小鼠第3天心肌組織中NLRP3炎性體被激活，其下游的caspase-1、IL-1β、IL-18表達(dá)增加，心肌組織中出現(xiàn)炎性細(xì)胞聚集[12]。既往研究還顯示，在病毒性心肌炎患者外周血中NLRP3被激活，并與疾病的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，使用參麥及黃芪等藥物可以明顯抑制NLRP3升高，減輕炎癥反應(yīng)[13-15]。本研究顯示，病毒感染的心肌細(xì)胞內(nèi)NLRP3被激活，其下游因子caspase-1表達(dá)上調(diào)，IL-1β、IL-18生成增多，敲減NLRP3基因的表達(dá)后可一定程度抑制CVB3病毒感染引起的心肌細(xì)胞中 caspase-1的活化，一定程度抑制IL-1β、IL-18的表達(dá)。提示NLRP3參與了病毒感染心肌細(xì)胞早期的炎癥反應(yīng)過(guò)程，抑制NLRP3的過(guò)度激活，有可能減輕病毒性心肌炎的炎癥反應(yīng)損傷。

心肌細(xì)胞凋亡是病毒性心肌炎直接損傷心肌細(xì)胞的主要機(jī)制之一。在病毒性心肌炎中Fas/FasL外源性凋亡途徑[16-17]，Bcl-2/Bax線粒體凋亡途徑均被激活,最終導(dǎo)致caspase-3活化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18-19]。既往研究報(bào)道，線粒體損傷可以激活NLRP3，同時(shí)NLRP3的激活進(jìn)一步加重線粒體損傷[20]。在晚期糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中，NLRP3、caspase-3和caspase-9的表增高，沉默NLRP3可通過(guò)抑制NF-κB P65來(lái)抑制caspase-3和caspase-9的增加，減輕心肌細(xì)胞凋亡[21]。有研究表明利用siRNA敲減NLRP3的表達(dá)可抑制心肌缺血再灌注心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低NF-κB的活化，上調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)有關(guān)[22]。還有研究顯示在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中用siRNA沉默NLRP3可抑制caspase-3的表達(dá)而減輕細(xì)胞凋亡[23]。shRNA干擾NLRP3后可以減輕心肌缺血再灌注大鼠模型中的心肌細(xì)胞損傷及凋亡，降低caspase-9、caspase-3凋亡蛋白的表達(dá)，其可能機(jī)制與抑制TGF-β/NF-κβp65/TNF-α炎癥通路活化有關(guān)[24]。敲減NLRP3基因的表達(dá)可以改善2型糖尿病大鼠模型中心功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡[25]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多種細(xì)胞因子參與其中并受多種基因的調(diào)控。在這復(fù)雜的多因素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，除了上述的caspase家族以外，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中也起著重要的作用。因此，本研究為了探討在病毒感染心肌細(xì)胞中NLRP3對(duì)心肌細(xì)胞凋亡途徑的影響，使用siRNA沉默NLRP3基因，研究其對(duì)細(xì)胞內(nèi)外凋亡途徑的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CVB3感染的心肌細(xì)胞模型中，caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白水平均增加，Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增高，Bax/Bcl-2比值增加，細(xì)胞凋亡增加。這與既往的研究結(jié)果一致[26-27]。當(dāng)敲減NLRP3基因表達(dá)后，cleaved caspase-3、cleaved-caspase-9的蛋白水平降低，Bcl-2降低程度減弱，但是對(duì)caspase-8、Bax無(wú)明顯影響，Bax/Bcl-2比值降低，心肌細(xì)胞凋亡降低，提示在病毒性心肌炎中NLRP3可一定程度上促進(jìn)線粒體凋亡途徑，加速細(xì)胞凋亡。本文主要在體外病毒感染心肌細(xì)胞模型中考察NLRP3的作用，同時(shí)只使用了基因干擾技術(shù)敲減NLRP3基因的表達(dá)來(lái)研究NLRP3的作用，未進(jìn)行NLRP3基因過(guò)表達(dá)的研究，具有一定的局限性。

4 結(jié)論

在病毒感染心肌細(xì)胞中NLRP3被激活，其下游的因子表達(dá)增高，心肌細(xì)胞凋亡增加。抑制NLRP3過(guò)度激活，可一定程度上減輕心肌細(xì)胞炎癥損傷及線粒體途徑介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提示NLRP3可能是病毒性心肌炎炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡相互聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。