張子曦 王永順 向洪聰 肖志波 夏學(xué)鑫 蔡志強(qiáng)

(1.湖北江漢油田總醫(yī)院麻醉科，湖北 潛江 433124；2.潛江市中心醫(yī)院麻醉科，湖北 潛江 433100；3.武漢科技大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院麻醉科，湖北 武漢 430064)

甲狀腺癌是最普遍的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)每年以3%的速度不斷增長[1]。乳頭狀甲狀腺癌是最常見的甲狀腺癌類型，占整個甲狀腺癌病例約90%[2]。當(dāng)前甲狀腺癌的治療選擇通常是手術(shù)切除或放射碘治療，在大多數(shù)情況下，乳頭狀甲狀腺癌在手術(shù)切除后預(yù)后良好，少數(shù)患者會復(fù)發(fā)或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。因此，迫切需要開發(fā)旨在阻斷乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)展的新治療策略。丙泊酚作為常用的靜脈麻醉藥，近年研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚(propofol,PPF)還可能具有抗腫瘤作用，如在腎癌、胃癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤治療過程中還表現(xiàn)出較好的抑瘤作用[4-6]。目前仍尚不清楚丙泊酚對乳頭狀甲狀腺癌的影響機(jī)制。因此，本研究擬在離體條件下探究丙泊酚通過線粒體凋亡通路對乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞凋亡和生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物和主要試劑 丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院，化學(xué)式：C12H18O，分子量：178.27，純度≥99.9%，Dulbecco's modified Eagle's medium培養(yǎng)基(12100-046)、胎牛血清(10082-147)、胰蛋白酶(25200-056)、青-鏈霉素(15140-122)購自美國Gibco公司，BRDU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(C0071S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)、線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1(C2006)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，總超氧化物歧化酶測定試劑盒(A001-3-2)、丙二醛測定試劑盒(A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所，Anti Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab53154)、Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、Caspase-9(ab52298)、cleaved Caspase-9(ab2324)、c-Myc(ab39688)購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳頭瘤狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并放置在37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2～3天更換一次，當(dāng)需要收集細(xì)胞時，用0.25%胰蛋白酶消化。試驗用細(xì)胞為對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞處理和分組 采用0、12.5、25、50 μM劑量[7]丙泊酚處理TPC-1細(xì)胞，將細(xì)胞隨機(jī)分為PPF 0 μM組、PPF 12.5 μM組、PPF 25 μM組和PPF 50 μM組4組。

1.4 BrdU染色 將細(xì)胞傳代接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，用含0.4 %FBS的培養(yǎng)液同步化孵育72 h。加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續(xù)孵育40 min。PBS洗滌細(xì)胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。鏡下觀察并計數(shù)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)。

1.5 克隆形成法 在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至大約30%匯合度，繼續(xù)培養(yǎng)4 d，吹散為單個細(xì)胞，用6孔板培養(yǎng)，約500個細(xì)胞每孔，培養(yǎng)14天，棄掉培養(yǎng)基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結(jié)晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進(jìn)行拍照觀察。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集懸浮細(xì)胞至10 mL的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為3×106/mL，500～1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000 r/min離心5 min，用100 μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時振動，流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.7 線粒體膜電位 將各組細(xì)胞接種于6孔板后PBS清洗三次，孵育24 h，加入JC-1(5 μg/mL)室溫避光反應(yīng)30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強(qiáng)度。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平 將各組待測細(xì)胞用PBS清洗三次，再加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照，并用ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達(dá)量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復(fù)三個獨立的實驗。

1.9 SOD、MDA、GSH含量測定 按照試劑盒說明書，采用酶標(biāo)儀測定總超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可見分光光度計測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚抑制TPC-1細(xì)胞增殖 BrdU染色檢測各組細(xì)胞增殖情況結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組BrdU陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 丙泊酚抑制TPC-1細(xì)胞生長 克隆形成實驗檢測各組細(xì)胞生長情況結(jié)果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組克隆形成率顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞生長的影響

2.3 丙泊酚下調(diào)TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測各組細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Ki67、PCNA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 丙泊酚促進(jìn)TPC-1細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況結(jié)果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25、50μM組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞凋亡的影響

2.5 丙泊酚降低TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位 JC-10檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果顯示，PPF 25和PPF 50 μM組細(xì)胞線粒體膜電位較PPF 0 μM組明顯降低，見圖5。

圖5 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.6 丙泊酚升高TPC-1細(xì)胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值顯著升高(P<0.05)，c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達(dá)水平的影響

2.7 丙泊酚升高TPC-1細(xì)胞MDA、GSH含量，降低SOD含量 試劑盒檢測各組細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量結(jié)果顯示。與PPF 0 μM組相比較，PPF 12.5 μM組SOD含量顯著降低(P<0.05)，MDA、GSH含量顯著升高(P<0.05)。PPF 50 μM組SOD含量顯著高于PPF 12.5 μM組(P<0.05)，PPF 12.5 μM組MDA、GSH含量顯著高于PPF 50μM組(P<0.05)，見表1。

表1 丙泊酚對TPC-1細(xì)胞SOD、MDA、GSH含量的影響

3 討論

丙泊酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥, 在各種手術(shù)的麻醉誘導(dǎo)中廣泛使用, 其特有的結(jié)構(gòu)能抑制炎癥細(xì)胞聚集、增殖、活化及減少釋放炎癥因子, 從而達(dá)到抗炎作用。丙泊酚可通過直接或間接作用抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和生存能力, 并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 從而達(dá)到有效的抗腫瘤作用[8]。手術(shù)治療是乳頭狀甲狀腺癌的首選方法，臨床上多選用丙泊酚對乳頭狀甲狀腺癌進(jìn)行麻醉[9]。

當(dāng)細(xì)胞增殖失控時會引起腫瘤的發(fā)生，因此調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖是治療腫瘤的必要手段[10]。Ki67是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核蛋白，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲,其蛋白表達(dá)在甲狀腺癌中明顯增高[11]。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA) 是一種與細(xì)胞增殖狀態(tài)有關(guān)的核蛋白，其隨著臨床分期增加和淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移, 表達(dá)水平逐漸增高，表明癌細(xì)胞增生活躍，與甲狀腺癌的臨床病理學(xué)特點和生物學(xué)行為有關(guān)，提示預(yù)后不良[12]。趙華宇等[13]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過降低Ki67表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖。王鵬等[14]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過下調(diào)PCNA表達(dá)抑制大鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞的增殖。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有下調(diào)TPC-1細(xì)胞Ki67、PCNA蛋白表達(dá)水平，提示丙泊酚通過抑制Ki67、PCNA表達(dá)抑制TPC-1細(xì)胞增殖。

凋亡是細(xì)胞程序性死亡，治療癌癥的化學(xué)預(yù)防策略之一就是誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡[15]；其分為外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑[16]。Caspase家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件, 可以通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Caspase-9、Caspase-3在凋亡級聯(lián)中過度活化能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]?？辜?xì)胞凋亡成員Bcl2，可防止細(xì)胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細(xì)胞質(zhì)，并在應(yīng)激下寡聚化，促進(jìn)線粒體釋放因子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。c-Myc是一種常見的原癌基因,可促進(jìn)細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在甲狀腺乳頭狀癌中高表達(dá)[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有降低升高TPC-1細(xì)胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/ Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調(diào)c-Myc蛋白表達(dá)水平的作用，提示丙泊酚通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)TPC-1細(xì)胞凋亡。

線粒體是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中有兩層膜包被的細(xì)胞器，是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu)。線粒體通透性孔的轉(zhuǎn)換對細(xì)胞的凋亡有著至關(guān)重要的作用, 一旦線粒體通透性孔打開, 小分子和離子就會流進(jìn)線粒體, 導(dǎo)致線粒體膜電位的改變[20]。線粒體膜內(nèi)外的電勢差降低，引起細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有降低TPC-1細(xì)胞線粒體膜電位的作用，提示丙泊酚通過降低線粒體膜電位調(diào)控TPC-1細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激是一種復(fù)雜的動態(tài)過程，其特點是保持活性氧生成與抗氧化劑的活性及有效性之間的平衡。線粒體作為真核生物進(jìn)行能量代謝的主要場所，在自由基產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡、衰老等生理病理活動中起到重要作用，是氧化應(yīng)激作用的重要靶細(xì)胞器。SOD和GSH是人體內(nèi)重要的酶抗氧化系統(tǒng)的主要成員，MDA則是機(jī)體內(nèi)重要的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物。郝琨等[21]研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚通過升高SOD含量，降低MDA含量緩解氧化應(yīng)激有利于結(jié)直腸癌根治術(shù)患者恢復(fù)。本文研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚具有升高TPC-1細(xì)胞MDA、GSH含量，降低SOD含量的作用，提示丙泊酚通過改善氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)TPC-1細(xì)胞增殖和凋亡。本研究只在細(xì)胞水平檢測丙泊酚的作用, 后期將做體內(nèi)實驗, 以更深入研究丙泊酚在乳頭狀甲狀腺癌中的作用。

4 結(jié)論

丙泊酚具有抑制乳頭狀甲狀腺癌TPC-1增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低線粒體膜電位，改善氧化應(yīng)激的作用，這可能是通過激活線粒體凋亡通路所實現(xiàn)。