陳思超 張冉 熊巧華 朱家永 張文杰 翁鴻,2,3,4 曾憲濤,2,3

(1. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢430071；2.武漢大學(xué)循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，湖北 武漢430071 ；3.武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院循證醫(yī)學(xué)與臨床流行病學(xué)教研室，湖北 武漢 430071；4.武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科，湖北 武漢 430071)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中第二常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是男性中第六常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。隨著人口老齡化、環(huán)境污染的加劇和診斷技術(shù)的提高，膀胱癌的發(fā)病率逐年上升[2-3]。膀胱癌主要由非侵襲性膀胱癌和侵襲性膀胱癌組成。其中，非侵襲性膀胱癌不侵犯膀胱肌層，約占70%[4]，標(biāo)準(zhǔn)治療方案為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)[5]，但術(shù)后1年內(nèi)疾病復(fù)發(fā)率為15%～60%[6-7]，總疾病復(fù)發(fā)率為40%～80%[8]。對(duì)于侵襲性膀胱癌患者，則推薦根治性膀胱切除術(shù)或經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)聯(lián)合放療化療。膀胱癌的治療現(xiàn)狀目前仍不是非常令人滿意，更深入地明確疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找新的診治方法非常重要。PBK (PDZ-binding kinase,PBK) 也被稱為淋巴因子激活的殺傷T細(xì)胞源蛋白激酶(Lymphokine-Activated Killer T-Cell-Originated Protein Kinase，TOPK)，在有絲分裂調(diào)控過(guò)程中起重要作用。PBK在包括結(jié)直腸癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種腫瘤中高表達(dá)，且伴隨PBK高表達(dá)的腫瘤患者預(yù)后常常更差[9-10]。然而，關(guān)于PBK 與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究卻較少。本研究將利用基因表達(dá)匯編(The Gene Expression Omnibus，GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)中的膀胱癌在線數(shù)據(jù)，分析并明確PBK基因的表達(dá)與膀胱癌生存預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)集來(lái)源 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載膀胱癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)GSE13507[11-12]。該數(shù)據(jù)集應(yīng)用Illumina公司的Illumina human-6v2.0 expression bead chip基因表達(dá)芯片，其中PBK基因?qū)?yīng)的探針為ILMN_1673673。GSE13507中包含165例原發(fā)性膀胱癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及年齡、性別、侵襲性、臨床分級(jí)、TNM分期、疾病進(jìn)展和疾病復(fù)發(fā)等臨床病理特征和生存狀態(tài)。

1.2 PBK表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后 應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較膀胱癌組織和正常膀胱組織的PBK基因表達(dá)量差異，然后根據(jù)PBK基因相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)將所有原發(fā)性膀胱癌樣本(n=165)分為低表達(dá)組(n=83)和高表達(dá)組(n=82), 接著應(yīng)用2檢驗(yàn)分析兩組患者臨床病理特征的差異，并應(yīng)用Kaplan-Meier法和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，從而探究PBK基因與原發(fā)性膀胱癌的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1.3 基因富集分析 利用基因富集分析法(gene set enrichment analysis，GSEA)探索PBK表達(dá)對(duì)膀胱癌預(yù)后的影響的可能機(jī)制。從GSEA網(wǎng)站MsigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取hallmark gene sets基因集為參照基因集，按照默認(rèn)加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法置換次數(shù)為1000次。以P<0.05及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率<0.25的基因集作為顯著富集基因集。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0(IBM Corp.，Armonk，NY)和GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc.，La Jolla，CA)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PBK在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)量比較 膀胱癌組織中PBK的相對(duì)表達(dá)量為 (8.30±0.99)，顯著高于正常膀胱組織 (7.49±0.69) (P<0.001)，見(jiàn)圖1。膀胱癌組織中PBK相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)為8.19，故PBK相對(duì)表達(dá)量小于等于8.19的患者歸于低表達(dá)組，共83例。而PBK相對(duì)表達(dá)量大于8.19 的患者歸于高表達(dá)組，共82例。

圖1 PBK在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的表達(dá)量

2.2 PBK表達(dá)量與膀胱癌臨床病理特征 在GSE13507數(shù)據(jù)集中，PBK表達(dá)與性別(P<0.001)、年齡(P=0.027)、侵襲性(P<0.001)、分級(jí)(P<0.001)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.015)、M分期(P<0.001)、疾病進(jìn)展(P<0.001)和疾病復(fù)發(fā)(P<0.001)顯著相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 PBK表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PBK高表達(dá)與膀胱癌預(yù)后 PBK高表達(dá)組的生存曲線比低表達(dá)組下降更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(HR=0.5133，95%CI：0.3180～0.8283，P=0.0023)；PBK高表達(dá)的膀胱癌患者也具有更低的腫瘤特異性生存率(HR=0.2873，95%CI：0.1428～0.5781，P=0.0003)，見(jiàn)圖2。表明PBK高表達(dá)的膀胱癌患者總生存率更低。

圖2 PBK表達(dá)與膀胱癌預(yù)后

2.4 GSEA分析 PBK高表達(dá)的膀胱癌細(xì)胞樣本富集了與MYC信號(hào)通路、G2M檢查點(diǎn)、精子發(fā)生、E2F轉(zhuǎn)錄因子、未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)的基因集，見(jiàn)表2。說(shuō)明PBK可能通過(guò)影響上述信號(hào)通路、檢查點(diǎn)或生理過(guò)程來(lái)影響膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。

表2 基因集富集分析

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)第二常見(jiàn)的惡性腫瘤。2018年全世界新發(fā)膀胱癌約有549000例，膀胱癌死亡病例約有200000例[1]。2014年中國(guó)新發(fā)膀胱癌約有78000例，全國(guó)膀胱癌死亡病例約為32100例[13]。當(dāng)前膀胱癌仍是一種治療手段有限且治療效果欠佳的疾病，迫切需要新的診治方法問(wèn)世。

PBK在腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程中起重要調(diào)控作用[14]。PBK的敲除會(huì)導(dǎo)致G2/M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[15]。此外，PBK也與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Yang等[16]研究表明PBK在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)ETV4-uPAR信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，與肝癌患者預(yù)后差密切相關(guān)。Ma等[17]研究表明PBK促進(jìn)高級(jí)別漿液性卵巢癌的轉(zhuǎn)移，且與鉑類化療藥物抵抗相關(guān)，其高表達(dá)會(huì)降低患者生存率。Ohashi等[18]研究表明，PBK的高表達(dá)與胃癌血管侵襲、腫瘤深度和復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)，PBK高表達(dá)的胃癌患者具有更低的腫瘤特異性生存率。

Krempler等[19]研究表明，G2M檢查點(diǎn)的不完整與電離輻射后S期和G2期細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性相關(guān)。且另有研究表明，G2M檢查點(diǎn)表達(dá)的下調(diào)或消除與細(xì)胞凋亡有關(guān)[20-21]。本研究顯示，當(dāng)PBK高表達(dá)時(shí)，膀胱癌中G2M檢查點(diǎn)的表達(dá)量是相對(duì)高的，表明高表達(dá)的PBK可能是通過(guò)上調(diào)G2M的表達(dá)使膀胱癌細(xì)胞凋亡受阻，從而影響膀胱癌患者預(yù)后。當(dāng)PBK表達(dá)上調(diào)時(shí)，精子發(fā)生過(guò)程中的基因也呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)。癌癥/睪丸抗原是一種僅在精子發(fā)生過(guò)程中的生殖細(xì)胞中和某些腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)的抗原，起原癌基因或抑癌基因的作用[22]。PBK已被證實(shí)是一種在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的新型癌癥/睪丸抗原[23]。李小輝等[24]研究表明當(dāng)膀胱癌細(xì)胞的E2F通路蛋白表達(dá)被microRNA-503-5P抑制時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制。本研究中PBK高表達(dá)時(shí)E2F通路蛋白的表達(dá)量相對(duì)較高。此外，之前的研究也表明膀胱癌細(xì)胞外小泡可通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的未折疊蛋白反應(yīng)使非惡性尿路上皮細(xì)胞完成惡性轉(zhuǎn)化[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)PBK基因在膀胱癌中高表達(dá)，且PBK表達(dá)量與膀胱癌侵襲性、臨床分級(jí)、TNM分期以及疾病復(fù)發(fā)、進(jìn)展密切相關(guān)，PBK表達(dá)量高的患者疾病總生存率和腫瘤特異性生存率均顯著低于PBK量低的患者。此外，GSEA分析發(fā)現(xiàn)PBK可能通過(guò)作用于MYC信號(hào)通路、G2M檢查點(diǎn)、精子發(fā)生、E2F轉(zhuǎn)錄因子通路、未折疊蛋白反應(yīng)等腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路或檢查點(diǎn)或生物學(xué)過(guò)程影響膀胱癌的預(yù)后?；谝陨辖Y(jié)果，PBK可能成為膀胱癌新型腫瘤標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。我們的研究也有其局限性，首先這是一個(gè)回顧性研究，尚不能確定；其次，本文只是對(duì)PBK調(diào)控的信號(hào)通路或生理過(guò)程做出假設(shè)，還需進(jìn)一步的臨床基礎(chǔ)研究最終確定PBK基因影響膀胱癌預(yù)后的具體通路。

4 結(jié)論

PBK在膀胱癌中高表達(dá)，與膀胱癌的多個(gè)臨床病理特征相關(guān)，這可能成為膀胱癌新型腫瘤標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)。