馬祥，賈志峰，劉勇

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，西寧 810016；2.青海省青藏高原優(yōu)良牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810016)

鹽堿地是制約我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素，據(jù)報(bào)道，我國約有9.913×107hm2鹽堿地，其中已開墾種植面積5.77×106hm2[1]。堿性土壤的形成通常是由NaHCO3和Na2CO3積累造成[2]。鹽堿含量過高通常導(dǎo)致土壤板結(jié)、肥力下降、植物生長抑制[3]。客土法和淋洗法是緩解土壤鹽堿脅迫的重要措施，但其成本高、工作量大且不能從根本上解決鹽堿地問題[1]。因此，探究植物適應(yīng)鹽堿脅迫機(jī)制，培育鹽堿耐受型作物對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境均具有積極意義。

通常認(rèn)為，土壤中離子濃度過高一方面導(dǎo)致植物受到滲透脅迫，不利于自身水分保持；另一方面，鹽離子進(jìn)入植物體造成膜質(zhì)損傷，不利于植物生長發(fā)育[4,5]。同時(shí)，鹽脅迫下土壤pH變高，破壞根部細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響根系正常生理功能[6,7]。此外，pH可導(dǎo)致土壤中部分離子溶解度降低或?qū)е码x子自由度降低，影響植物對(duì)離子的吸收[8]。離子代謝穩(wěn)態(tài)的改變和組織pH平衡破壞通常導(dǎo)致植物萎蔫和發(fā)黃[6,9]。植物有多種途徑抵御鹽脅迫，例如根系抗鹽性[10]、葉片泌鹽[11]以及Na+在液泡中的區(qū)隔化[12]。除此之外，植物還可通過調(diào)節(jié)自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如：游離脯氨酸、甜菜堿、可溶性糖等適應(yīng)脅迫環(huán)境[13,14]。

鹽脅迫下，植物光合作用減弱，過量的光照導(dǎo)致光和系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)和光和系統(tǒng)Ι(PSΙ)活性減弱，光合速率下降，造成活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)爆發(fā)，引起氧化脅迫[15]。PSⅡ和PSΙ是光合色素蛋白復(fù)合物，PSⅡ介導(dǎo)從水到質(zhì)體醌的非循環(huán)電子傳遞，藻膽蛋白作為PSⅡ的主要捕光天線附著在類囊體膜基質(zhì)表面，鹽脅迫下，藻膽蛋白含量降低，阻斷了能量從藻膽蛋白到PSⅡ的傳遞[16]。眾多研究表明，鹽脅迫下植物葉綠素含量、凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度降低，胞間二氧化碳濃度升高[17-19]。有效的光保護(hù)機(jī)制可以提高植物的抗逆性，植物可通過D1蛋白的快速周轉(zhuǎn)[20]、提高抗氧化酶活性[15]、PSΙ系統(tǒng)中的電子流循環(huán)[21]、光呼吸和葉黃素循環(huán)[15,20]等途徑適應(yīng)脅迫條件下的光抑制。植物根系感受到鹽脅迫信號(hào)后，由脫落酸(Abscisic Acid，ABA)傳遞至地上部分，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉[22]。有研究指出，光合作用通路上的基因和蛋白一般與脅迫相關(guān)性較小[23]，而與脅迫后的恢復(fù)相關(guān)性較大[24]。盡管以上研究揭示了大量光合作用相關(guān)機(jī)制，但光合作用在鹽脅迫條件下的分子機(jī)制尚不明確。

燕麥?zhǔn)俏覈匾哪敛葙Y源，主要在我國北方地區(qū)種植，具有適口性好、營養(yǎng)豐富、草產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[25]。我國北方地區(qū)土壤鹽堿化嚴(yán)重，給牧草種植繁育和生態(tài)環(huán)境帶來嚴(yán)重危害。通過探究燕麥在鹽脅迫條件下的適應(yīng)機(jī)制，改善作物本身對(duì)鹽堿脅迫的適應(yīng)能力，對(duì)緩解鹽堿脅迫對(duì)燕麥生產(chǎn)造成的不良影響及改善生態(tài)環(huán)境均具有重要的實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用由青海畜牧獸醫(yī)科學(xué)院提供的燕麥 “青燕一號(hào)”為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)在青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實(shí)施。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

選取顆粒飽滿、大小一致的燕麥種子若干，用蒸餾水沖洗干凈，70%酒精浸泡1min，20%次氯酸鈉浸泡15min，蒸餾水沖洗5～6次，晾干后均勻栽種至填裝蛭石的育苗缽(10cm×10cm)中，每缽25株，每天噴灑蒸餾水至種子萌發(fā)后用Hoagland營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)14d后施加處理。

將碳酸氫鈉(NaHCO3)溶解至Hoagland營養(yǎng)液中模擬鹽脅迫，NaHCO3濃度為200mmol/L，以不施加處理且僅添加Hoagland營養(yǎng)液的燕麥幼苗為對(duì)照(CK)，分別在處理后1d、3d、5d、7d時(shí)測定其各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)

葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、總?cè)~綠素(TChl)：采用95%乙醇浸泡法[26]。

凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)：采用GSF-3000光合儀測定，選擇標(biāo)準(zhǔn)葉室面積8cm2，設(shè)置光照強(qiáng)度1400 μmol m-2s-1，測定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

原卟啉(IX)、鎂—原卟啉(Mg-IX)、原葉綠素酸酯(PChl)：參照?？e[20]的方法。

基因表達(dá)量：采用實(shí)時(shí)熒光定量(qRT-PCR)的方法，在LightCycler 96實(shí)時(shí)熒光定量儀(Roche，瑞士)中執(zhí)行qRT-PCR分析，采用的試劑盒為SYBR RPremix DimerEraserTMKit (TaKaRa，日本)，反應(yīng)體系20 μL，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，內(nèi)參基因?yàn)锳sactin[27]，采用2-△△CT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。使用Primer3(version 0.4.0)(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。基因特異性引物序列如下表。

表1 基因列表及其引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)燕麥葉綠素和Protocol IX、Mg-IX 、PChl含量的影響

圖1顯示，鹽脅迫下燕麥葉片 Chla、Chlb、TChl、Proto IX、Mg-Proto IX、PChl含量均隨處理天數(shù)增加而顯著下降(P<0.05)。Chlb和PChl含量在處理1d時(shí)，與CK相比差異不顯著(P>0.05)；處理第7d時(shí)，Chlb降幅最大，比CK降低73.54%，差異極顯著(P<0.001)。PChl在處理后7d時(shí)含量比CK降低22.68%，降幅最小。相對(duì)于鹽脅迫對(duì)Proto IX、Mg-Proto IX、PChl含量的影響而言，鹽脅迫下Chla、Chlb、TChl下降趨勢更為明顯。

2.2 鹽脅迫對(duì)燕麥光和、蒸騰和呼吸特性的影響

圖2顯示，鹽脅迫下，燕麥葉片Pn、Tr、Gs均呈顯著降低趨勢(P<0.05)，胞間二氧化碳濃度增加。在脅迫后1d時(shí)，燕麥葉片Pn、Tr、Ci變化相對(duì)Gs而言較小，而處理1d即可對(duì)燕麥葉片Gs產(chǎn)生極顯著抑制作用(P<0.001)。處理至第7d時(shí)，燕麥葉片Pn、Tr、Gs與CK相比均產(chǎn)生極顯著差異(P<0.001)，分別比CK降低67.29%、70.07%、66.87%。而Ci隨著處理天數(shù)增加，也依次增加，依次比CK增加2.25%、11.42%、23.48%、28.29%，相對(duì)Pn、Tr、Gs而言，鹽脅迫對(duì)燕麥葉片Ci影響較小。

2.3 鹽脅迫對(duì)燕麥葉綠素合成途徑基因表達(dá)的影響

圖3顯示，鹽脅迫下，處理時(shí)間為1d時(shí)，Mg-Ch基因上調(diào)表達(dá)，而PBGD、PRO和CLS基因均下調(diào)表達(dá)，隨著處理時(shí)間增加至3d以后，PBGD、PRO、Mg-Ch和CLS基因均下調(diào)表達(dá)。PRO基因和CLS基因均在處理3d時(shí)即顯著下調(diào)，此后，隨著處理時(shí)間增加，PRO基因和CLS基因均顯著下調(diào)。PBGD基因在第7d時(shí)相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，而Mg-Ch基因在處理第5d和第7d時(shí)均顯著下調(diào)。

2.4 鹽脅迫對(duì)燕麥葉綠素降解途徑基因表達(dá)的影響

鹽脅迫顯著誘導(dǎo)燕麥葉片葉綠素降解途徑PAO和PPH基因上調(diào)表達(dá)(圖4)，隨著處理天數(shù)增加，PAO基因和PPH基因上調(diào)表達(dá)量亦隨之增加。處理第5 d時(shí)PAO基因相對(duì)表達(dá)量最高，比CK高45.70倍，鹽脅迫誘導(dǎo)的PAO基因表達(dá)變化比PPH基因更加明顯。

3 討論

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，通常認(rèn)為，葉綠素合成分為四個(gè)階段，第一階段為來自谷氨酸或α-酮戊二酸經(jīng)δ-氨基酮戊酸合成的PBG；進(jìn)入第二階段，PBG作為底物，聚合形成Proto IX，Proto IX進(jìn)一步結(jié)合Mg形成Mg-ProtoIX；在第三階段，PChl在NADPH和光照條件下進(jìn)行還原反應(yīng)，生成葉綠酸酯a作為第四階段生成葉綠素的前體物質(zhì)；進(jìn)入第四階段后，加葉醇尾巴形成Chla，Chla的甲基被醛基取代形成Chlb，至此Chla和Chlb合成[13,20,23]。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致燕麥葉片Proto IX、Mg-Proto IX、PChl含量顯著降低，抑制Chla和Chlb合成，同時(shí)，Chla、Chlb、TChl含量顯著降低，可能是因?yàn)橐环矫?，鹽脅迫抑制葉綠素從頭合成，另一方面，鹽脅迫破壞葉綠素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉綠素含量降低。類似的結(jié)果還出現(xiàn)在關(guān)于番茄(SolanumlycopersicumL.)[28]，玉米(ZeamaysL.)[29]，甜瓜(CucumismeloL.)[30]等植物中。

葉綠素合成需要一系列的酶促反應(yīng)參與，PBGD基因是葉綠素合成通路上游的重要酶，土豆(SolanumlycopersicumL.)在鹽脅迫下PBGD基因顯著下調(diào)表達(dá)，抑制葉綠素合成[31]〗，本研究中，鹽脅迫也導(dǎo)致燕麥葉片PBDG基因顯著下調(diào)，說明鹽脅迫可通過抑制PBDG基因表達(dá)而抑制燕麥葉片中的葉綠素合成。在關(guān)于蠶豆(ViciafabaL.)的研究中發(fā)現(xiàn)了一種ABA受體蛋白，被命名為ABAR(Putativeabscisicacidreceptor)。此基因作為ABA特定的受體蛋白接收ABA信號(hào)并調(diào)控氣孔關(guān)閉，而Mg-Ch基因可以與ABAR基因特異性結(jié)合，介導(dǎo)ABA信號(hào)在質(zhì)體與細(xì)胞核信號(hào)之間的傳遞。除此之外，Mg-Ch基因在葉綠素合成中葉具有核心作用[32-34]。在我們的研究中，鹽脅迫導(dǎo)致Mg-Ch基因在第1d時(shí)上調(diào)表達(dá)，隨后下調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)榈?d時(shí)植物感受到鹽脅迫信號(hào)后產(chǎn)生的防御反應(yīng)，而隨著處理時(shí)長增加，鹽脅迫抑制Mg-Ch基因表達(dá)。通常認(rèn)為POR基因在植物發(fā)育中具有關(guān)鍵作用，POR基因催化葉綠素合成的最后步驟合成葉綠素酸酯，在生物環(huán)境中，這種酶催化的光反應(yīng)引發(fā)了植物形態(tài)發(fā)育的顯著，在超微結(jié)構(gòu)水平上表現(xiàn)為對(duì)質(zhì)膜的修飾和重組[35,36]。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致燕麥葉片POR基因顯著下調(diào)，結(jié)果顯示了鹽脅迫對(duì)燕麥葉片葉綠素合成的抑制作用。CLS基因已被證明參與熱脅迫下擬南芥葉綠素周轉(zhuǎn)中的葉綠素再利用過程[37]，葉綠素合酶活性的降低可導(dǎo)致δ-氨基酮戊酸含量減少和Mg、Fe螯合酶活性降低，而CLS基因表達(dá)可增強(qiáng)δ-氨基酮戊酸合成并增加螯合酶活性[38]。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致CLS基因顯著下調(diào)，這可能是導(dǎo)致葉綠素代謝抑制的重要原因。通過分析PBGD基因、Mg-Ch基因、POR基因、CLS基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式，證明鹽脅迫對(duì)葉綠素關(guān)鍵合成酶具有明顯抑制作用，影響葉綠素合成，但Mg-Ch基因在第1d時(shí)上調(diào)表達(dá)，可能是燕麥相應(yīng)鹽脅迫的候選基因。

葉綠素在脅迫條件下或衰老過程中的分解是植物發(fā)育過程中必不可少的一部分，葉綠素降解導(dǎo)致無色分解代謝產(chǎn)物的積累。脫鎂葉綠酸a加氧酶和葉紅素分解還原酶參與脫鎂葉綠酸卟啉環(huán)的氧解，PAO基因表達(dá)只在葉片衰老過程中增加其活性。因此認(rèn)為，PAO基因是葉綠素分解代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[39,40]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下PAO基因顯著上調(diào)表達(dá)，因此認(rèn)為，鹽脅迫可能導(dǎo)致葉綠素降解加快。PPH基因是廣泛分布于藻類和陸地植物中于葉綠體中的由衰老誘導(dǎo)的基因，在擬南芥中PPH基因特異性分解脫鎂葉綠素并生成脫鎂葉綠酸，而擬南芥PPH基因突變體pph-1在葉片衰老時(shí)葉綠素在葉片積累，擁有保持綠色的表型性狀[41]。鹽脅迫下，燕麥葉片PPH基因顯著上調(diào)，這可能是葉綠素降解的另一重要原因。因此，鹽脅迫導(dǎo)致燕麥葉綠素降解關(guān)鍵基因上調(diào)是其葉綠素代謝失衡的重要原因。且PAO基因表達(dá)量變化更加顯著，證明其在葉綠素降解途徑具有更關(guān)鍵的作用。

凈光合速率是植物光合作用積累有機(jī)物效率的重要指標(biāo)，王寧[42]等研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫導(dǎo)致酸漿(PhysalispubescensL.)凈光合速率先增后降，在低濃度下促進(jìn)光合，而高濃度鹽脅迫導(dǎo)致凈光合速率下降，抑制光合作用。植物蒸騰作用不僅受外界環(huán)境條件的影響，也受到自身?xiàng)l件的影響，鹽脅迫導(dǎo)致植物體內(nèi)滲透勢變化已被廣泛報(bào)道[43-45]。同時(shí)，氣孔導(dǎo)度是影響光合作用、蒸騰作用和呼吸作用的主要因素，影響氧氣和二氧化碳及水分在植物體內(nèi)的流通[17,18,30]。本研究中，鹽脅迫導(dǎo)致燕麥葉片凈光合速率、蒸騰速氣孔導(dǎo)度顯著降低，胞間二氧化碳濃度增加，可能是因?yàn)辂}脅迫引起燕麥體內(nèi)滲透勢變化并抑制葉綠素合成，加快葉綠素降解。

4 結(jié)論

鹽脅迫可抑制燕麥葉片葉綠素合成基因表達(dá)，促進(jìn)葉綠素降解基因表達(dá)，抑制葉綠素前體物質(zhì)的合成并減少葉綠素含量，抑制植物光合作用并降低凈光合速率。同時(shí)，鹽脅迫可降低燕麥葉片蒸騰速率及增強(qiáng)其呼吸作用。Mg-Ch基因可能是燕麥響應(yīng)鹽脅迫的關(guān)鍵基因，而PAO基因在鹽脅迫下燕麥葉綠素降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。