金鑫燕

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

生長(zhǎng)激素受體 (growth hormone receptor，GHR)是眾多被認(rèn)為影響泌乳性能候選基因中影響泌乳性狀較多的一個(gè)基因,牛GHR基因位于20號(hào)染色體，由10個(gè)exon和9個(gè)子intron組成，基因序列SNP突變會(huì)使該基因結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及該基因介導(dǎo)的生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)基因的生理效應(yīng)[1]，最終使泌乳、生產(chǎn)等經(jīng)濟(jì)性狀發(fā)生改變。將牛GHR基因作為候選基因，研究該基因與泌乳、生產(chǎn)性能的關(guān)系，對(duì)牛的育種具有重大實(shí)踐意義[2]。國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因第8exon T/A替換，使其編碼的氨基酸呈現(xiàn)F279Y轉(zhuǎn)換，顯著影響牛的泌乳性能[3-7]。也有研究表明，GHR基因部分外顯子多態(tài)產(chǎn)生的不同基因型對(duì)乳脂率[8、9]、乳蛋白百分含量[10]有影響。本研究對(duì)青海澤庫(kù)高原型牦牛GHR基因部分片段進(jìn)行了SNP多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)合乳成分?jǐn)?shù)據(jù)分析了該SNP多態(tài)對(duì)乳成分的影響，旨在為下一步針對(duì)牦牛乳選育提高提供一定的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自青海省澤庫(kù)縣某牧場(chǎng)，采集32頭(胎次為2～3胎，年齡為6～7歲，產(chǎn)犢時(shí)間為當(dāng)年4月底到5月初)泌乳牦母牛頸靜脈血樣5mL，干冰運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，-20℃冷凍保存。

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA提取采用柱式血液基因組DNA抽提試劑盒(生工)。提取后DNA采用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。

1.3 引物序列及PCR反應(yīng)程序

PCR引物設(shè)計(jì)參照NCBI 中登錄號(hào)為AM161140.1序列。

表1 牦牛GHR基因片段 1、2、exon 8 擴(kuò)增引物序列

PCR反應(yīng)體系：DNA模板2μL，引物F、R 各2μL，dNTP 2μL，10×Taq buffer 5μL，Taq酶 0.5μL，加ddH2O至50μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min；94℃變性30 sec，55℃退火30sec，72℃延伸50 sec；35 cycle，72℃修復(fù)延伸6 min。

1.4 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序

PCR產(chǎn)物切膠后經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收后冷凍，冷凍樣品干冰送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序及檢測(cè)SNP。

1.5 乳成分?jǐn)?shù)據(jù)測(cè)定

乳樣采集時(shí)間為7月底純放牧條件下，采集50ml泌乳牦母牛奶樣干冰運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，用超聲波乳品分析儀檢測(cè)乳脂肪、乳蛋白、非脂乳固體、密度、冰點(diǎn)、鹽、電導(dǎo)率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件采用IBM SPSS Statistics 22，分析各乳成分的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差及SNP產(chǎn)生不同基因型組各乳成分差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛GHR基因部分片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

引物1擴(kuò)增片段1長(zhǎng)度為635bp，引物2擴(kuò)增片段2長(zhǎng)度為772bp，引物3擴(kuò)增Exon 8片段長(zhǎng)度為470bp。

2.2 牦牛GHR基因部分片段SNP多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

本試驗(yàn)所有樣本中未發(fā)現(xiàn)片段1、exon 8 SNP多態(tài)性，片段2發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)1個(gè)，第82位T。

2.3 CC型和CT型各乳成分平均值比較

CC型和CT型占比為3∶1，CT型各乳成分含量平均值比CC型較高。CC基因型和CT基因型兩組平均數(shù)采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)法比較差異顯著性，結(jié)果表明，不同基因型間冰點(diǎn)值P<0.05，說(shuō)明CC基因型和CT基因型間冰點(diǎn)值差異顯著，CC基因型冰點(diǎn)值顯著高于CT型，CC型為該群體優(yōu)勢(shì)基因型。其它乳成分不同基因型間差異不顯著。

表2 不同基因型間牦牛乳成分均值及差異顯著性比較

3 討論與結(jié)論

(1)對(duì)中國(guó)荷斯坦牛GHR基因第8 exon F279Y位點(diǎn)SNP與泌乳性能的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，該SNP與305d泌乳量、乳脂率和乳蛋白率顯著相關(guān)[11]。馬彥男等[12]研究表明，該位點(diǎn)突變形成的AA基因型305d泌乳量顯著高于AT基因型，而AT基因型在305d乳脂量、305d乳蛋白含量和305d乳糖量高于AA基因型，等位基因A對(duì)高產(chǎn)奶量有正效應(yīng)，等位基因T對(duì)乳成分有正效應(yīng)，并表明該F279Y突變可針對(duì)性應(yīng)用于中國(guó)荷斯坦牛泌乳性狀的標(biāo)記輔助選育中。然而在本試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)牦牛GHR基因第8 exon F279Y位點(diǎn)突變，可能是樣品數(shù)量較少的原因，該位點(diǎn)在牦牛群體中是否存在突變有待進(jìn)一步研究。

(2)生乳冰點(diǎn)是衡量生乳中是否添加水的重要指標(biāo)之一[13]。20世紀(jì)初，冰點(diǎn)被正式應(yīng)用于牛乳中摻水鑒定[14]，檢測(cè)儀器最早利用Hortvet冰點(diǎn)儀進(jìn)行[15]。隨著科技的發(fā)展，現(xiàn)在已研制出多種冰點(diǎn)儀[16]。鑒于冰點(diǎn)儀在技術(shù)上的持續(xù)優(yōu)化、奶牛飼養(yǎng)管理、擠奶方式、產(chǎn)奶量等變化，普通牛乳中正常冰點(diǎn)值范圍也一直是研究熱點(diǎn)。20世紀(jì)60年代 Stubbs[17]、Dahlberg[18]、Hortvet測(cè)定的普通牛乳冰點(diǎn)均值低于-0.540℃，20世紀(jì)90年代各國(guó)研究冰點(diǎn)值范圍為-0.530～-0.520℃[19]，現(xiàn)在普遍認(rèn)同的荷斯坦牛乳冰點(diǎn)均值為-0.525～-0.521℃[20]。研究表明[21]品種差異、個(gè)體差別、季節(jié)變化、乳房炎、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等因素均會(huì)影響牛乳冰點(diǎn)值。目前對(duì)冰點(diǎn)值的研究大多局限于普通荷斯坦牛乳，有關(guān)牦牛乳冰點(diǎn)值方面的研究報(bào)道極為罕見(jiàn)。對(duì)牦牛乳冰點(diǎn)值也沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)可參考，且各地方品種和類(lèi)群牦牛間乳成分差異較大，研究牦牛乳的冰點(diǎn)值能為今后牦牛生鮮乳收購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要的理論依據(jù)。研究表明牦牛乳冰點(diǎn)與乳糖、乳蛋白、非脂乳固體呈極顯著負(fù)相關(guān)[22]。該結(jié)論與李玲等[23]對(duì)水牛乳冰點(diǎn)值與滴定酸度、蛋白質(zhì)、脂肪、總固形物以及乳糖+灰分總量存在極顯著負(fù)相關(guān)性的結(jié)論相同。

(3)有關(guān)牦牛GHR基因?qū)γ谌樾阅苡绊懙难芯繄?bào)道極為少見(jiàn)，對(duì)該基因的研究?jī)H限于該基因在牦牛不同組織中的表達(dá)及對(duì)生長(zhǎng)性狀影響的研究[24]。對(duì)麥洼牦牛GHR基因SNP多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)第5exon存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)形成3種基因型TT/TC/CC，TT基因型管?chē)鷺O顯著高于TC和CC基因型，TC和CC基因型差異不顯著，CC為優(yōu)勢(shì)基因型[25]。本試驗(yàn)所測(cè)片段2SNP位點(diǎn)產(chǎn)生的CC基因型冰點(diǎn)值顯著高于CT基因型，CC型為該群體優(yōu)勢(shì)基因型。再結(jié)合冰點(diǎn)與其它乳成分的極顯著相關(guān)性，是否可由此針對(duì)性的開(kāi)展分子育種有待進(jìn)一步研究。