荀順義，朱 海，劉 慶，單繼軍

（博瑞生物醫(yī)藥泰興市有限公司，江蘇泰興 225400）

1 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA合成的影響分析

攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA合成影響較強(qiáng)，會(huì)影響生物反應(yīng)機(jī)制以及氧傳遞，因此，也稱為生物合成γ-PGA以及提升產(chǎn)率的重要問(wèn)題。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，提高轉(zhuǎn)速以及采用高純氧，能夠有效控制容量，以解決該問(wèn)題，提升γ-PGA的生產(chǎn)速率。高轉(zhuǎn)速對(duì)于發(fā)酵體系傳質(zhì)來(lái)說(shuō)具有重要作用，但較高轉(zhuǎn)速也會(huì)形成剪切力作用，對(duì)培養(yǎng)群體細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。之外，攪拌轉(zhuǎn)速較大，還會(huì)形成大量泡沫，使發(fā)酵體積增加，對(duì)于發(fā)酵來(lái)說(shuō)是不利的，因此，研究非流動(dòng)型流體發(fā)酵參數(shù)，利于優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程，提高γ-PGA產(chǎn)率。本研究在5L發(fā)酵罐中分析了不同轉(zhuǎn)速對(duì)于分批發(fā)酵γ-PGA的影響，具體如下。

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在本研究中所使用的實(shí)驗(yàn)儀器，包括電子天平、5升發(fā)酵罐、恒溫?fù)u床、紫外檢測(cè)器、生物傳感器、電熱恒溫干燥箱、精密pH計(jì)、凝膠滲透色譜柱等。所使用的試劑包括硫酸鎂、硫酸銨、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鉀、谷氨酸鈉等。實(shí)驗(yàn)菌種為Bacillus snbtilis NX2，使用平板基類型，包括斜面基、平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 研究方法

在具體培養(yǎng)中，接菌于斜面和平板培養(yǎng)基中，將其置于32℃，24h培養(yǎng)。接一環(huán)菌將其置于50mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中，轉(zhuǎn)速為220r/min，置于32.5℃，培養(yǎng)15h。以5%接種量將種子接種液置于3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，通氣量為0.8vv m， 溫度設(shè)置為32.5℃，通過(guò)控制轉(zhuǎn)速進(jìn)行發(fā)酵。測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)，包括濁度及細(xì)胞干重。測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖以及谷氨酸濃度，可使用生物傳感器進(jìn)行測(cè)定。

2 研究結(jié)果

攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)Bsubtilis NX2細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生的影響。使用不同轉(zhuǎn)速包括300、400、600、800、1 000r/min，分析在發(fā)酵時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)速會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，提高攪拌轉(zhuǎn)速，會(huì)增加菌體生長(zhǎng)速率，達(dá)到菌體濃度最大值，使時(shí)間有一定程度縮短。當(dāng)轉(zhuǎn)速為1 000r/min時(shí)，在24h生物量達(dá)到最高值。當(dāng)轉(zhuǎn)速為300r/min時(shí)，生物量在68h可達(dá)到最高值，較大攪拌轉(zhuǎn)速利于發(fā)酵液傳質(zhì)，以及細(xì)胞對(duì)底物的消耗。由于γ-PGA是在細(xì)胞膜中合成，并將其分泌到胞外的，是細(xì)胞莢膜的重要成分。莢膜中產(chǎn)物高濃度會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、產(chǎn)物合成。攪拌轉(zhuǎn)速越高時(shí)，會(huì)使莢膜更快散落，降低莢膜對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及氧傳遞阻礙，因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，攪拌轉(zhuǎn)速越高，此時(shí)菌體的代謝周期會(huì)越短，會(huì)促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。當(dāng)轉(zhuǎn)速為1 000r/min時(shí)，此時(shí)生物量可達(dá)到最高值，濃度為7.72g/L。分別比較不同攪拌轉(zhuǎn)速下細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以及殘余葡萄糖曲線結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)與葡萄糖濃度具有一定聯(lián)系，在發(fā)酵后期葡萄糖逐漸消耗盡之后，細(xì)胞衰亡，并且提高攪拌轉(zhuǎn)速，會(huì)加快細(xì)胞凋亡速度。

3 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA產(chǎn)率的影響分析

結(jié)合上述研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)使γ-PGA產(chǎn)量有所降低，主要由于菌體衰亡，γ-PGA降解酶在其中發(fā)揮作用。在處于較高轉(zhuǎn)速下，體系傳輸速度較快，能夠使細(xì)胞濃度在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到飽和，之后衰亡，γ-PGA產(chǎn)率較低。在處于較低攪拌轉(zhuǎn)速下，體系傳質(zhì)慢，γ-PGA合成率降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速為400r/min時(shí)，此時(shí)PGA的產(chǎn)值最高，其濃度可達(dá)到21.78g/L。轉(zhuǎn)速對(duì)γ-PGA平均分子量的影響。γ-PHA以及衍生物加工和應(yīng)用，從一定程度上是與平均分子量具有緊密聯(lián)系的，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需求，在發(fā)酵過(guò)程中γ-PGA平均分子量也是其重要指標(biāo)。

4 γ-PGA分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)γ-PGA發(fā)酵相關(guān)研究較多，大多數(shù)集中于菌種選育、合成機(jī)理、發(fā)酵工藝化等，很少涉及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究。針對(duì)γ-PGA生產(chǎn)菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性研究，包括γ-PGA合成速率和基質(zhì)濃度變化規(guī)律、菌體生長(zhǎng)速率等，利于有效控制發(fā)酵過(guò)程，以提高γ-PGA物質(zhì)的產(chǎn)率，降低企業(yè)生產(chǎn)成本。根據(jù)Richarda等人研究表明，PGA和生物聚合物分批發(fā)酵模型中觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯的抑制效果。拓展細(xì)胞生長(zhǎng)是符合Monod方程的，產(chǎn)物的濃度是擴(kuò)展細(xì)胞與實(shí)際細(xì)胞濃度差值。利用該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的模型，沒(méi)有考慮外源谷氨酸對(duì)于γ-PGA物質(zhì)合成產(chǎn)生的影響，該模型能夠用于生長(zhǎng)發(fā)酵期，沒(méi)有考慮發(fā)酵后期影響。對(duì)于本次研究群體Bacillus subtilis NX2為谷氨酸依賴型菌，γ-PGA合成產(chǎn)物的谷氨酸單體來(lái)源于外源谷氨酸，少量則來(lái)源于葡萄糖。

4.1 研究材料和方法

在本次研究中，所采用的菌種信號(hào)為Bacillussubtilis NX-2。由于B.Subtilis為谷氨酸依賴型菌，在無(wú)谷氨酸基礎(chǔ)上，無(wú)法合成γ-PGA。外源谷氨酸是該菌株γ-PGA前體以及γ-PGA合成的重要活化劑，該群體能夠利用葡萄糖以及谷氨酸合成γ-PGA，具體路徑如圖1所示。

圖1 葡萄糖以及谷氨酸合成γ-PGA路徑

4.2 研究結(jié)果

分析γ-PGA分批發(fā)酵代謝變化以及動(dòng)力學(xué)。5L發(fā)酵罐中初始葡萄糖濃度為40g/L，將其置于32.5℃，400r/min下，分批發(fā)酵γ-PGA，如圖2所示。

圖2 γ-PGA分批發(fā)酵代謝變化以及動(dòng)力學(xué)變化

根據(jù)該結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)與葡萄糖濃度具有緊密聯(lián)系的，當(dāng)耗盡葡萄糖之后，菌體會(huì)進(jìn)入衰亡期，繼續(xù)合成，而隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)使γ-PGA存在一定程度的降解。分析菌體生長(zhǎng)速率以及γ-PGA合成速率隨時(shí)間變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ-PGA物質(zhì)在發(fā)酵中，菌體成長(zhǎng)可分為4個(gè)階段，包括延遲期、加速生長(zhǎng)期、減速期、衰亡期。在菌體合成γ-PGA質(zhì)時(shí)，發(fā)酵前期γ-PGA合成是與細(xì)胞生長(zhǎng)保持同步的，當(dāng)菌體生長(zhǎng)至一定時(shí)期，會(huì)受多種因素的影響，降低其生長(zhǎng)速率，但仍會(huì)以較高的速率合成γ-PGA物質(zhì)，因此，表明γ-PGA物質(zhì)的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定聯(lián)系。在細(xì)胞反應(yīng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，主要是由于存在部分物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起到抑制作用。根據(jù)γ-PGA濃度對(duì)于菌體生長(zhǎng)速率產(chǎn)生的影響，可以發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖濃度為30~60g/L時(shí)，細(xì)胞增殖濃度理論值與實(shí)驗(yàn)值能夠獲得一定吻合，當(dāng)葡萄糖的初始濃度為30~50g/L時(shí)，利用動(dòng)力學(xué)方程能夠反映γ-PHA的生物合成過(guò)程。γ-PGA產(chǎn)率理論值與實(shí)驗(yàn)值相關(guān)性為0.99以上，當(dāng)葡萄糖初始濃度為60g/L，此時(shí)γ-PGA產(chǎn)率理論值與實(shí)驗(yàn)值在發(fā)酵后期存在一定偏離，表明本研究所構(gòu)建的模型，在一定程度上能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5 γ-PGA物質(zhì)的分離提取

5.1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)中使用菌株分批發(fā)酵，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)發(fā)酵獲得γ-PGA發(fā)酵液，將發(fā)酵液稀釋25倍之后，使其光密度值為0.323，濃度對(duì)應(yīng)24g/L，發(fā)酵液呈淡黃色。將pH調(diào)至3.0，取1L發(fā)酵液，分別采用不同孔徑微濾膜處理，比較發(fā)酵原液以及透過(guò)液菌體含量、產(chǎn)物濃度，計(jì)算菌體去除率以及產(chǎn)物損失率。

5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

pH及溫度對(duì)γ-PGA酵液黏度的影響分析。在發(fā)酵過(guò)程中γ-PGA培養(yǎng)基pH為中性，聚谷氨酸由于側(cè)鏈具有游離羧基，導(dǎo)致其帶有負(fù)電荷，可作為菌株莢膜重要成分分泌至胞外，因已經(jīng)替代負(fù)電荷菌體，無(wú)法聚集，而懸浮于發(fā)酵液中。γ-PGA分子量較大，在胞外逐漸積累之下，會(huì)使發(fā)酵液黏度提高，給菌液分離以及γ-PGA物質(zhì)分離純化提高難度，通過(guò)pH對(duì)發(fā)酵體系黏度影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH由7調(diào)至3，會(huì)降低發(fā)酵液的黏度，當(dāng)pH低于3時(shí)，發(fā)酵液黏度變化不明顯，在堿性條件下黏度較高。當(dāng)pH為6時(shí)，黏度降低，當(dāng)pH為3時(shí)，黏度達(dá)3kcp，主要由于pH會(huì)影響γ-PGA分子構(gòu)象，酸性溶液中γ-PHA分子為β片層結(jié)構(gòu)，中性條件下則為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在堿性下為收縮隨機(jī)結(jié)構(gòu)，不同pH條件所表現(xiàn)的黏度變化不同。當(dāng)pH低于4時(shí)，溫度對(duì)于發(fā)酵液體系黏度產(chǎn)生影響不明顯，在常溫下可進(jìn)行菌液分離以及產(chǎn)物超濾提取。結(jié)合pH對(duì)γ-PGA物質(zhì)分子構(gòu)象產(chǎn)生的影響，可以推測(cè)，在酸性條件下，γ-PGA分子相比中性、堿性易于透過(guò)微濾膜，因此，選擇pH為3時(shí)，進(jìn)行發(fā)酵微濾除菌。

6 結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究了不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)B.subtilis NX-2分批發(fā)酵γ-PGA產(chǎn)生的影響，最終選擇了400r/min攪拌轉(zhuǎn)速，該菌體物質(zhì)產(chǎn)率較高，可達(dá)到21.78g/L，在處于該轉(zhuǎn)速下，對(duì)該菌體γ-PGA代謝變化和動(dòng)力學(xué)分析，構(gòu)建細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型，求解模型參數(shù)后，獲得γ-PGA分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，該模型表明在30~60g/L葡萄糖初始濃度下，細(xì)胞增殖濃度理論值與實(shí)驗(yàn)值具有良好吻合度。當(dāng)初始葡萄糖濃度低于50g/L，γ-PGA生物合成產(chǎn)率理論值和實(shí)驗(yàn)值具有良好吻合，當(dāng)葡萄糖初始液濃度為60g/L時(shí)，此時(shí)γ-PGA產(chǎn)率理論值和實(shí)驗(yàn)值在發(fā)酵后期存在一定的偏離，將發(fā)酵液pH調(diào)至3，采用0.8um孔徑微濾膜，其除菌率為70.9%，產(chǎn)物損失率為5%。