胡晟，張小文

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科二病區(qū)，昆明 650101)

良性膽管狹窄(benign biliary strictures，BBS)最常發(fā)生于術(shù)后或長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)之后，患者可能無(wú)癥狀，或僅出現(xiàn)肝功能異常，或伴有嚴(yán)重黃疸，甚至并發(fā)重癥膽管炎危及生命[1]。研究表明[2]，在膽管重建中成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)增殖明顯，F(xiàn)B在膽管瘢痕增生和BBS發(fā)展中起重要作用。FB可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)，F(xiàn)B所分泌的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分能夠?qū)⒋罅竣裥湍z原蛋白(Collagen Ⅰ)、Ⅲ 型膠原蛋白(Collagen Ⅲ)沉積，促進(jìn)膽管瘢痕組織的形成，具有收縮特性的α-肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)進(jìn)一步促進(jìn)膽管組織瘢痕性攣縮，進(jìn)而導(dǎo)致組織不斷纖維化，最終導(dǎo)致BBS形成[3]。同時(shí)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號(hào)通路過(guò)表達(dá)同樣在BBS形成過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[4]。芹菜素(Apigenin)是一種常見(jiàn)的黃酮類(lèi)化合物，存在于各種水果和蔬菜中，如：歐芹、洋蔥、蘋(píng)果和某些調(diào)味料。芹菜素由于其抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)靜、降血壓和抑制腫瘤增生作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注[5]。芹菜素被證明可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，如：前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和白血病細(xì)胞等[6]。目前已經(jīng)闡明了芹菜素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的幾種機(jī)制，包括細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)異常和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)等[7]。然而，筆者尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道芹菜素對(duì)人良性膽管瘢痕成纖維細(xì)胞(human benign bile duct scar fibroblasts，HBBDSF)的影響。筆者研究原代培養(yǎng)HBBDSF并鑒定，使用芹菜素干預(yù)細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移和凋亡水平的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人良性膽管瘢痕組織經(jīng)過(guò)患者知情同意，由我院肝膽胰外科二病區(qū)提供。人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)、人胚肺二倍體細(xì)胞(HDM1)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)。芹菜素(Apigenin)(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：A800500，規(guī)格：100 mg，含量≥98%)；改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)(Sigma公司，批號(hào)：D5796)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(批號(hào)：C0227)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)(批號(hào)：ST447)、胰酶細(xì)胞消化液(0.25%胰酶，含酚紅)(批號(hào)：C0203)、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(批號(hào)：C0041)、BeyoClickTMEDU-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C0071S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：C1062S)購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗人Vimentin(批號(hào)：WL01960)、兔抗人Keratin(批號(hào)：WL03015)、兔抗人TGF-β1(批號(hào)：WL02998)、兔抗人α-SMA(批號(hào)：WLH3879)、兔抗人Collagen I(批號(hào)：WL0088)、兔抗人Collagen III(批號(hào)：WL03186)、兔抗人β-Actin(批號(hào)：WL01372)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(批號(hào)：WLA031)購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 經(jīng)手術(shù)獲得的硬化膽管使用無(wú)菌PBS溶液清洗5次，無(wú)菌精細(xì)眼科剪剪為1 mm3大小。將組織分散至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置入37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。分離純化成纖維細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至85%時(shí)消化、傳代。利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞Vimentin及Keratin抗體的表達(dá)進(jìn)行細(xì)胞鑒定[9]。陽(yáng)性對(duì)照選用HSF細(xì)胞，陰性對(duì)照選用HDM1細(xì)胞。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)及增殖抑制率 將細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞數(shù)量1×103個(gè)·mL-1，預(yù)先配制不同濃度梯度的芹菜素溶液(5，10，20，40，80 μmol·L-1)。次日棄去培養(yǎng)液，加入各濃度的芹菜素溶液繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h。每孔中加入CCK-8溶液10 μL，1 h后于全波長(zhǎng)自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(型號(hào)：SPECTROstar Nano，產(chǎn)地：德國(guó)BMG公司)測(cè)定450 nm處吸光度(A)值。使用GraphPad Prism 8繪制IC50曲線(xiàn)及計(jì)算IC50值；計(jì)算人膽管瘢痕成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：抑制率(%)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)÷對(duì)照組A值×100%。

1.2.3EDU-488法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 將細(xì)胞接種至24孔板，細(xì)胞數(shù)量5×103個(gè)·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實(shí)驗(yàn)組(10，20 μmol·L-1)，對(duì)照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日，向每孔中加入2X EDU工作液300 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。之后4%的多聚甲醛室溫固定15 min，再用含3%BSA的PBS洗滌3次，后加0.3% Triton X-100的PBS室溫培養(yǎng)15 min，洗滌后每孔中加入Click反應(yīng)液100 μL室溫避光培養(yǎng)30 min，接著每孔加入Hoechst33342(1000X)染料500 μL室溫避光培養(yǎng)20 min。最后在全自動(dòng)熒光顯微鏡(型號(hào)：EVOS M7000，產(chǎn)地：賽默飛世爾科技有限公司)下觀(guān)察并攝像記錄。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，計(jì)算增殖細(xì)胞比率(%)=增殖細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況 將細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞數(shù)量1×104個(gè)·mL-1。次日，使用無(wú)菌200 μL槍頭垂直于昨日所標(biāo)記的黑線(xiàn)進(jìn)行劃痕，PBS 1X清洗1～2次。加入IC50濃度以下的芹菜素作為實(shí)驗(yàn)組(10、20 μmol·L-1)，對(duì)照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡(型號(hào)：EVOS XL CORE，產(chǎn)地：Thermo公司)下于0，6，12，24 h分別觀(guān)察并攝像記錄。得到原始圖片后使用Image J版軟件進(jìn)行劃痕面積的定量計(jì)算。

1.2.5高速分析型流式細(xì)胞儀(型號(hào)：Attune Nxt，產(chǎn)地：賽默飛世爾科技有限公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將細(xì)胞接種至6孔板，細(xì)胞數(shù)量1×104個(gè)·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實(shí)驗(yàn)組(10，20 μmol·L-1)4 h以誘導(dǎo)凋亡，對(duì)照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。4 h后消化6孔板內(nèi)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式上樣管中，再向流式上樣管中依次加入Annexin V-FITC結(jié)合液195 μL、Annexin V-FITC溶液5 μL、碘化丙啶染色液10 μL并輕輕混勻室溫避光染色15 min，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.2.6免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白的表達(dá)情況 將細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞數(shù)量1×103個(gè)·mL-1。次日，加入IC50濃度以下的芹菜素作為實(shí)驗(yàn)組(10、20 μmol·L-1)，對(duì)照組僅加入同等體積的含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)情況，在熒光顯微鏡下觀(guān)察并攝像記錄。

1.2.7Western blotting檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)情況 提取各組細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)并計(jì)算蛋白濃度，以SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gel elextrophoresis，SDS-PAGE)凝膠進(jìn)行電泳。使用聚偏 二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)轉(zhuǎn)膜，再行封閉處理，以1：5000比例稀釋一抗，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)磷酸緩沖液清洗PVDF膜3～5次。以1：5000比例稀釋二抗，并室溫孵育2 h，TBST磷酸緩沖液再次清洗PVDF 膜3～5次。β-actin作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)條帶的灰度值采用Quantity one軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果

2.1HBBDSF的鑒定結(jié)果 原代培養(yǎng)的HBBDSF在光鏡下呈不規(guī)則三角形，隨之逐漸轉(zhuǎn)化為梭形的單核細(xì)胞，此時(shí)形態(tài)與成纖維細(xì)胞十分近似。原代培養(yǎng)的第5代HBBDSFD的Vimentin、Keratin均為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(表現(xiàn)為強(qiáng)烈的綠色熒光)，鑒定成纖維細(xì)胞主要是根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和Vimentin、Keratin抗體的細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行。根據(jù)細(xì)胞光鏡下形態(tài)及免疫熒光結(jié)果可證明此細(xì)胞為HDDBSF。陽(yáng)性對(duì)照組(HSF)結(jié)果Vimentin陽(yáng)性而Keratin陰性表達(dá)，陰性對(duì)照組(HDM1)均表達(dá)為陰性。詳見(jiàn)圖1～3。

2.2CCK-8法檢測(cè)芹菜抑制細(xì)胞IC50值及芹菜素對(duì)細(xì)胞增殖影響的結(jié)果 選取48 h的重復(fù)測(cè)量5次的吸光度(A)值進(jìn)行IC50值計(jì)算芹菜素IC50=22.75 μmol·L-1，R2=0.797，見(jiàn)圖4。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇的芹菜素藥物濃度均在IC50值以下(10，20 μmol·L-1)。20 μmol·L-1組在24，48和72 h時(shí)與10 μmol·L-1比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明芹菜素的干預(yù)濃度越高則對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率也越高。圖4、見(jiàn)表1。

A.Vimentin(+)；B.Keratin(+)。

A.Vimentin(+)；B.Keratin(-)。

A.Vimentin(-)；B.Keratin(-)。

2.3EDU-488法檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞增殖影響的結(jié)果 被綠色熒光染色的代表增殖細(xì)胞，未被綠色熒光染色的為正常細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組比較，10，20 μmol·L-1組的細(xì)胞增殖百分比均降低(P<0.01)；相對(duì)于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細(xì)胞增殖百分比降低(P<0.05)。見(jiàn)圖5，6。

2.4細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞遷移影響的結(jié)果 使用面積表示細(xì)胞劃痕區(qū)域，該實(shí)驗(yàn)顯示12 h和24 h中，與對(duì)照組比較，10，20 μmol·L-1組細(xì)胞遷移后剩余面積均升高(P<0.05)；相對(duì)于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細(xì)胞遷移后剩余面積增大(P<0.05)。見(jiàn)圖7～10。

Log[C]代表芹菜素溶液(80，40，20，10，5 μmol·L-1)的對(duì)數(shù)值。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞凋亡影響的結(jié)果 利用二、四象限細(xì)胞百分比進(jìn)行單因素方差分析，與對(duì)照組比較，10，20 μmol·L-1組的細(xì)胞早晚期凋亡百分比均升高(P<0.05)；相對(duì)于10 μmol·L-1組，20 μmol·L-1組的細(xì)胞早晚期凋亡百分比升高(P<0.05)。見(jiàn)圖11，12。

表1 芹菜素對(duì)HBBDSF增殖的抑制率

2.6免疫熒光技術(shù)檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ 和Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)情況的結(jié)果 免疫熒光實(shí)驗(yàn)中綠色熒光代表陽(yáng)性表達(dá)，且綠色熒光越強(qiáng)則表達(dá)越強(qiáng)，反之亦然。本例中，對(duì)照組細(xì)胞對(duì)TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光，10，20 μmol·L-1的芹菜素組均表現(xiàn)出較弱的綠色熒光。說(shuō)明芹菜素作用下，細(xì)胞對(duì)4種蛋白表達(dá)均減弱。見(jiàn)圖13。

圖5 EDU-488法檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞增殖抑制的熒光圖(×100)

①與對(duì)照組比較，t=13.412，16.263，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=4.930，P<0.05。

2.7Western blotting檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)情況的結(jié)果 經(jīng)過(guò)芹菜素72 h刺激后，與對(duì)照組比較，10，20 μmol·L-1芹菜素組對(duì)TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達(dá)水平均降低(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較，隨著芹菜素濃度增高，抑制細(xì)胞4種蛋白表達(dá)能力越強(qiáng)(P<0.05)，詳見(jiàn)圖14。

3 討論

在膽管損傷及修復(fù)過(guò)程中，增生性瘢痕形成是不可避免的，在肝內(nèi)外膽管中，增生性瘢痕的形成與BBS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。FB在膽管損傷修復(fù)中有重要地位，它是由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)干細(xì)胞分化發(fā)育而形成的。組織損傷后，F(xiàn)B擴(kuò)增并轉(zhuǎn)化成MFB，后者會(huì)分泌ECM，不斷攣縮并填補(bǔ)組織缺損。一般情況下，只要組織缺損能夠表皮化，F(xiàn)B和MFB凋亡的進(jìn)程就會(huì)加快，而且ECM分泌會(huì)顯著減少，組織修復(fù)的過(guò)程就趨向終止；另外，如果FB和MFB不斷大量增生，同時(shí)ECM持續(xù)過(guò)量積累，則會(huì)逐漸形成增生性瘢痕，最終形成BBS[11]。

圖7 對(duì)照組細(xì)胞劃痕面積變化示意圖(×40)

圖8 芹菜素10 μmol·L-1組細(xì)胞劃痕面積變化示意圖(×40)

圖9 芹菜素20 μmol·L-1組細(xì)胞劃痕面積變化示意圖(×40)

①與對(duì)照組比較，t=-158.921，0.770，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=-49.676，8.059，P<0.05。

TGF-β1是一種具備多樣生物學(xué)效能的蛋白分子，是與膽管瘢痕形成最緊密的蛋白，它對(duì)于細(xì)胞的增生、組織瘢痕形成等病理生理過(guò)程起到了重要作用[12]。組織受到損傷后，F(xiàn)B和MFB中TGF-β1蛋白的表達(dá)量會(huì)顯著提高，并且TGF-β1積聚到一定量又能刺激FB大量增生，促使組織損傷后的修復(fù)系統(tǒng)激活[13]。TGF-β1重點(diǎn)是靠TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路繼而發(fā)揮其作用，抑制瘢痕組織和瘢痕FB中TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)是目前治療瘢痕的主要手段之一[14]。

α-SMA表達(dá)為陽(yáng)性為MFB特征性的標(biāo)識(shí)，MFB同時(shí)具備FB和平滑肌細(xì)胞的特征，它有比較強(qiáng)的伸縮特性，也能分泌多量的ECM和調(diào)節(jié)ECM相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)[15]。FRANGOGIANNIS[16]發(fā)現(xiàn)，在膽管瘢痕組織中ECM特別是其中的CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白過(guò)量堆積，正常組織中MMPs和TIMPs可維持ECM的微環(huán)境以保持平衡，當(dāng)組織受到損傷后MMPs和TIMPs的表達(dá)會(huì)不同于尋常，影響ECM的降解和代謝，導(dǎo)致其過(guò)量堆積，繼而形成瘢痕。膽管瘢痕FB和MFB中α-SMA的表達(dá)情況也受到TGF-β1含量的影響[17]。

圖11 流式細(xì)胞儀檢測(cè)芹菜素對(duì)細(xì)胞凋亡影響的散點(diǎn)圖

①與對(duì)照組比較，t=-13.254，-5.902，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=-4.685，P<0.05。

圖13 3組對(duì)TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達(dá)的免疫熒光圖(×200)

圖14 芹菜素對(duì)TGF-β1、α-SMA、Collagen I和Collagen Ⅲ 蛋白表達(dá)的影響

①與對(duì)照組比較，t=4.531，35.961，P<0.05；②與芹菜素10 μmol·L-1組比較，t=6.029，30.898，P<0.05。

近年來(lái)，中藥及其衍生物在治療組織瘢痕中的應(yīng)用已得到廣泛研究[18]。芹菜素具有抗腫瘤特性，并對(duì)一些慢性炎癥性疾病具有一定的療效。體外研究表明[19]，芹菜素可通過(guò)TGF-β1途徑抑制成纖維細(xì)胞的遷移，從而發(fā)揮治療哮喘和慢性鼻竇炎的作用。RICUPERO等[20]報(bào)道芹菜素通過(guò)抑制肺成纖維細(xì)胞的Akt途徑抑制成肌纖維細(xì)胞的增殖、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達(dá)，并降低TGF-β1誘導(dǎo)的α-SMA的表達(dá)。JUN等[21]證明在體外ECM重塑模型中，生理濃度的芹菜素抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的膠原蛋白凝膠收縮。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的系統(tǒng)性硬化小鼠模型中，芹菜素抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。然而，關(guān)于膽管瘢痕的研究很少。筆者首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討了芹菜素在膽管瘢痕成纖維細(xì)胞中的作用機(jī)制。本研究結(jié)果首次表明芹菜素可抑制細(xì)胞增殖和遷移，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。且芹菜素可降低細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)，芹菜素通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響HBBDSF的一系列生物學(xué)行為，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。