陳小燕，吳應(yīng)強(qiáng)，朱蓉，趙逵

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1.消化內(nèi)科；2.全科醫(yī)學(xué)科，遵義 563099)

近年來，隨著人們生活方式的改變，結(jié)腸癌發(fā)病率上升位居世界第三的惡性腫瘤[1]。發(fā)病年齡日益年輕化，治療也面臨諸多挑戰(zhàn)，早期防治結(jié)腸癌具有十分重要的意義。雖然放射治療、化學(xué)治療和生物治療等方法在結(jié)腸癌治療中顯示出顯著的療效，但并不能徹底治愈結(jié)腸癌，這一臨床問題隨著腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs) 概念[2-3]的提出得到了更好地解釋。LENG等[4]研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌中致瘤細(xì)胞高度局限于Lgr5陽性亞群，與Lgr5陰性亞群比較，Lgr5陽性亞群表現(xiàn)出更高的集落形成能力、自我更新能力、分化能力、致瘤性以及干細(xì)胞基因和間充質(zhì)基因的高表達(dá)能力。Lgr5目前作為結(jié)腸腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)研究已成為熱點(diǎn)。新近研究顯示，Lgr5是Wnt通路的目標(biāo)基因，Lgr5蛋白在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、侵潤、轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后均密切相關(guān)[5]，進(jìn)一步表明Lgr5參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，可能作為一個潛在的治療靶點(diǎn)[6]。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究顯示，阿司匹林能降低腺瘤和結(jié)腸癌發(fā)生的風(fēng)險，有效預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生[7]，但其作用機(jī)制未明確。阿司匹林是如何作用于腫瘤干細(xì)胞以及對腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物有何影響，目前尚不清楚。筆者前期研究[8-10]結(jié)果顯示阿司匹林能夠抑制HT-29(COX-2高表達(dá))和SW-480(COX-2陰性表達(dá))人結(jié)腸癌細(xì)胞株中如Lgr5等多種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。對于阿司匹林如何影響人結(jié)腸癌細(xì)胞株COX-2低表達(dá)的Caco-2中Lgr5表達(dá)，筆者進(jìn)行了深入研究，進(jìn)一步探討阿司匹林防治結(jié)腸癌發(fā)生的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2由湖南湘雅大學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。阿司匹林購自美國Sigma公司，含量>99.0%，批號：16326。胎牛血清(購自美國Hyclone公司)、DMEM高糖培養(yǎng)基(購自美國Hyclone公司)、胰蛋白及MTT(購自美國Sigma公司)，AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、兔抗人Lgr5多克隆抗體(購自北京中杉金橋公司)，Lgr5引物、β-actin引物(購自北京江晨宏偉生物科技有限公司)，SYBR Premix Ex Taq 、PrimeScriptTM RT Reagent Kit(購自大連寶生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的杜爾伯克改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM)中，37.0 ℃、50 mL·L-1二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁融合度約為80%～90%時，用胰蛋白酶-EDTA混合消化液消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時選取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.2.2噻唑藍(lán)(MTT)法檢測阿司匹林對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞存活率的影響 Caco-2細(xì)胞消化離心后重懸于培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105個·mL-1，接種于96板，每孔100 μL；空白組用培養(yǎng)基代替，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜；空白組及對照組加入培養(yǎng)基100 μL，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的阿司匹林，濃度分別為1.0，1.5，2.5，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0 mmol·L-1，各100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔；加藥后分別培養(yǎng)24，48和72 h，每孔吸掉上清液100 μL后加入0.5%MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解震蕩10 min，酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司，型號MULTISKAN SPECTRUM)測定490 nm波長處的吸光度(A值)。細(xì)胞的生長抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%；計(jì)算阿司匹林對結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度IC50，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 消化傳代Caco-2細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁過夜后加入各濃度的阿司匹林(5.0，10.0，15.0 mmol·L-1)作用12 h，以及15.0 mmol·L-1阿司匹林分別作用6，12和24 h后消化，離心2000 r·min-1×5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細(xì)胞；PBS洗滌細(xì)胞2次(2000 r·min-1×5 min)；加入500 μL的結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide)，混勻；室溫、避光、反應(yīng)15 min；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司，型號：MOFLO)檢測，重復(fù)3次。

1.2.4實(shí)時-反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Caco-2細(xì)胞中Lgr5 mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組加入10 mmol·L-1阿司匹林2 mL，分別作用6，12和24 h，對照組則加入2 mL培養(yǎng)基，消化收集各組細(xì)胞懸液，運(yùn)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，全波段酶標(biāo)儀測定樣品中RNA的純度及濃度，采用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄c DNA；以cDNA 為模板，分別擴(kuò)增β-actin 和Lgr5 基因，用于RT-PCR的引物對是由大連寶生物工程公司合成，β-actin上游引物序列(5′-3′)為：TGGCACCCAGCACA ATGAA，下游引物序列(5′-3′)為：CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；Lgr5上游引物序列(5′-3′)為：GCTCATGGTAAAACACATTGCCC，下游引物序列(5′-3′)為：TGGGACTACCACCAGAAGGATA；收集擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，參照引物設(shè)計(jì)要求，每組標(biāo)本中隨機(jī)選取一個，取擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠10 μL，100 V、75 mA電壓電泳30～40 min，以進(jìn)一步印證擴(kuò)增產(chǎn)物。最后紫外分析儀(北京通用分析儀器公司，型號Tu-1810)上觀察結(jié)果；利用ΔΔCt 2法，即2-ΔΔCT計(jì)算出各時間組樣本細(xì)胞中Lgr5/β-actin比值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5免疫組化檢測不同濃度阿司匹林作用后Caco-2細(xì)胞中Lgr5蛋白亞細(xì)胞定位變化 采用免疫組化EnVision 二步法。制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后分別加入0，5.0，10.0，15.0 mmol·L-1阿司匹林作用24 h后，取出蓋玻片；4%多聚甲醛固定；0.5%TritonX-100處理；先后用3%H2O2及2%牛血清白蛋白100 μL室溫孵育；加一抗(1：600，陰性對照組用PBS代替一抗)4 ℃孵育過夜；加二抗37 ℃孵育1 h；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，雙蒸水洗，晾干，封片，顯微鏡觀察攝像。Lgr5蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒。具體操作步驟嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)染色試劑盒要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2存活的影響 MTT結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，阿司匹林對Caco-2細(xì)胞生長的抑制率逐漸增大，呈時間和濃度依賴性，見圖1，但濃度超過20.0 mmol·L-1時，抑制率不再明顯增大。通過SPSS軟件計(jì)算得出干預(yù)24，48，72 h阿司匹林的IC50分別為13.649，9.090，6.925 mmol·L-1。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞凋亡的結(jié)果

2.2.1細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，空白對照組Caco-2細(xì)胞呈梭形，形態(tài)均一，貼壁良好，透光性強(qiáng)。5.0，10.0，15.0 mmol·L-1的阿司匹林作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞貼壁能力明顯減弱，細(xì)胞變圓變小，大小不一，數(shù)量減少，見圖2。

①與對照組比較，P<0.05；②與24 h組比較，P<0.05；③與48 h組比較，P<0.05。

圖2 不同濃度阿司匹林作用24 h后Caco-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)

2.2.2AnnexinⅤ-FITC檢測Caco-2細(xì)胞凋亡的結(jié)果①流式細(xì)胞儀檢測不同濃度阿司匹林對細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度阿司匹林作用Caco-2細(xì)胞12 h后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞早期凋亡率(AnnexinⅤ+/PI-)和總凋亡率(AnnexinⅤ+)，見圖3。與對照組比較，5.0，10.0，15.0 mmol·L-1的阿司匹林均可明顯提高Caco-2細(xì)胞早期凋亡率；除5.0 mmol·L-1組外，其余各組亦可提高Caco-2細(xì)胞總凋亡率(n=9，P<0.05)，且阿司匹林促凋亡作用成濃度依賴性，見圖3。

①與對照組比較，P<0.05；②與5.0 mmol·L-1比較，P<0.05；③與10.0 mmol·L-1比較，P<0.05。

②流式細(xì)胞術(shù)檢測阿司匹林作用不同時間對細(xì)胞凋亡的影響 15.0 mmol·L-1的阿司匹林分別作用Caco-2細(xì)胞0，6，12，24 h后流式檢測各組早期凋亡率和總凋亡率，見圖4，各時間組早期凋亡率分別為(5.7±1.7)%，(6.5±1.2)%和(13.7±0.65)%，與對照組比較，均可明顯提高Caco-2細(xì)胞早期凋亡率；總凋亡率分別為(14.7±1.6)%，(37.0±5.4)%，(70.1±7.2)%，除6 h組，其余各組亦可提高Caco-2細(xì)胞總凋亡率(n=9，P<0.05)，且阿司匹林促凋亡作用呈時間依賴性。

①與對照組比較，P<0.05；②與6 h組比較，P<0.05；③與12 h組比較，P<0.05。

2.3阿司匹林對結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2中Lgr5 mRNA表達(dá)的影響 10 mmol·L-1阿司匹林分別作用于Caco-2細(xì)胞6，12，24 h后進(jìn)行 RT-PCR分析，以β-actin為內(nèi)參照，檢測各組Lgr5基因表達(dá)變化，見表1、表2。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳成像顯示β-actin、Lgr5長度分別為186 bp、146 bp，均在預(yù)定位置，進(jìn)一步印證了擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖5。對照組Lgr5 mRNA校正灰度值為65.33±2.52，6 h組、12 h組、24 h組分別為29.00±2.00，36.33±3.06，10.33±1.52。與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組Lgr5mRNA的表達(dá)均有不同程度下調(diào)，其中以12 h組最為明顯，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果說明阿司匹林下調(diào)了Lgr5 mRNA的轉(zhuǎn)錄。

2.4Lgr5免疫組化結(jié)果 Lgr5蛋白免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色顆粒。結(jié)果顯示Lgr5蛋白在人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞中大量表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)定位于細(xì)胞膜，而細(xì)胞核不著色，見圖6。5.0 mmol·L-1組中Lgr5蛋白亞細(xì)胞定位與對照組相同，也在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜表達(dá)；10.0 mmol·L-1組和15.0 mmol·L-1組可見Lgr5蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)生了改變，除了細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)有表達(dá)外，細(xì)胞核也有明顯表達(dá)，見圖6。

表1 10.0 mmol·L-1 阿司匹林對Caco-2 細(xì)胞Lgr5 mRNA 表達(dá)的影響

表2 阿司匹林作用不同時間下Lgr5基因改變的倍數(shù)

3 討論

研究顯示阿司匹林能夠顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2的生長，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11-13]。阿司匹林對細(xì)胞的抑制作用是否與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5有關(guān)呢？本實(shí)驗(yàn)通過研究阿司匹林對人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2中Lgr5表達(dá)的影響，旨在從腫瘤干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物角度探討其對結(jié)直腸癌防治作用，進(jìn)一步揭示其所涉及的相關(guān)機(jī)制。

SAIGUSA等[14-15]研究對體外培養(yǎng)且被照射后的結(jié)腸癌細(xì)胞和術(shù)前放化療的直腸癌患者中Lgr5基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，病理分化程度差及腫瘤復(fù)發(fā)的患者中Lgr5基因表達(dá)量較對照組明顯增高，其生存期更短，上述結(jié)果表明Lgr5基因過度表達(dá)可能與直腸癌對放化療耐藥性有關(guān)，導(dǎo)致直腸癌患者的腫瘤復(fù)發(fā)，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，直腸癌、結(jié)腸癌的發(fā)病情況類似，因此，Lgr5可以作為一個判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的理想指標(biāo)，是一個新的潛在治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過測定阿司匹林作用6，12和24 h后Caco-2細(xì)胞中Lgr5mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)阿司匹林對Lgr5基因表達(dá)有明顯的抑制作用，呈良好的時間依賴性，其中以12 h組下調(diào)最為明顯，表明阿司匹林主要是集中在12 h內(nèi)對Lgr5mRNA的表達(dá)有顯著抑制作用。由此推測阿司匹林通過抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞Lgr5基因表達(dá)而防治結(jié)腸癌。那么，阿司匹林抑制Lgr5基因表達(dá)涉及的具體機(jī)制是什么呢？研究表明阿司匹林等NSAIDs可能通過降低COX的表達(dá)[16-17]而抑制Wnt/β-catenin信號通路[18]，并減弱β-catenin/TCF下游靶基因Lgr5的轉(zhuǎn)錄，以干預(yù)腫瘤的發(fā)生，這一研究理論印證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。筆者前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示阿司匹林可能是通過COX-2途徑和非COX-2途徑，且主要通過非COX-2途徑預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中采用的細(xì)胞株是COX-2低表達(dá)的Caco-2，阿司匹林對Caco-2中Lgr5基因表達(dá)抑制呈時間依賴性，這也表明了阿司匹林防治結(jié)腸癌的機(jī)制可能涉及非COX-2途徑。

M：Marker，1-4泳道為β-actin mRNA(186 bp)在對照組、6 h組、12 h組和24 h組中的表達(dá)；5-8泳道為Lgr5mRNA(146 bp)在對照組、6 h組、12 h組和24 h組中的表達(dá)。

圖6 Lgr5蛋白在不同濃度阿司匹林作用后Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)部位

多數(shù)研究[19-22]已經(jīng)證實(shí)，Lgr5蛋白在結(jié)腸癌、腦膠質(zhì)瘤、卵巢癌等多種人體實(shí)體腫瘤中存在高表達(dá)情況。Lgr5蛋白在結(jié)腸癌中不僅大量表達(dá)，而且還存在著表達(dá)分布的差異。通過比較正常結(jié)腸、癌前病變、結(jié)腸腺瘤以及不同分化的腺瘤、不同分期的腺癌等相關(guān)研究表明，Lgr5蛋白的空間分布存在著明顯的區(qū)別[23-24]。正常結(jié)腸組織中，Lgr5在其腔面表達(dá)；在癌前病變組織中，Lgr5的表達(dá)不再局限于隱窩基底部；而在結(jié)腸腺瘤中Lgr5主要在腔面高表達(dá)。此外，在分化程度高的腺瘤中，Lgr5主要在隱窩部表達(dá)，較少在腔面表達(dá)，反之亦然；腫瘤分期晚的腺癌中，Lgr5也主要在腔面表達(dá)。這進(jìn)一步表明，Lgr5的失巢表達(dá)預(yù)示著腸道干細(xì)胞向癌前病變轉(zhuǎn)變，并與腫瘤分化、分期明顯相關(guān)，其在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中具有十分重要的作用。因在不同病理狀態(tài)下，實(shí)體組織中的Lgr5蛋白存在著空間分布的差異。那么Lgr5蛋白在結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位是否會因?yàn)樗幬锏纫蛩馗深A(yù)后而出現(xiàn)平面分布的差異呢？這是不是阿司匹林防治結(jié)腸癌的又一種機(jī)制呢？本實(shí)驗(yàn)中，采用免疫組化檢測各濃度阿司匹林作用Caco-2細(xì)胞 24 h后Lgr5蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)部位變化，結(jié)果顯示Lgr5蛋白在人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞中大量表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)定位于細(xì)胞膜，而細(xì)胞核不著色。柴寧莉等[25]通過研究不同病理狀態(tài)腸息肉中Lgr5蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Lgr5免疫組化陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。5.0 mmol·L-1組中Lgr5蛋白亞細(xì)胞定位與對照組相同，估計(jì)是由于作用時間不夠長或者藥物濃度不高，還不足以導(dǎo)致Lgr5蛋白的表達(dá)部位發(fā)生變化。隨著阿司匹林藥物濃度提高，10.0 mmol·L-1組和15.0 mmol·L-1組可見Lgr5蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)生了改變，除了細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)有表達(dá)外，細(xì)胞核也有表達(dá)。由此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿司匹林能夠影響Lgr5蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)部位的改變，且與阿司匹林濃度有關(guān)。柴寧莉等[25]研究還顯示了Lgr5蛋白在正常黏膜細(xì)胞核和細(xì)胞膜幾乎不表達(dá)，但在Lgr5蛋白強(qiáng)表達(dá)的腺瘤和腸癌中，細(xì)胞膜也有一定的表達(dá)，表明了Lgr5的細(xì)胞中表達(dá)部位與腸息肉的病理狀態(tài)有關(guān)，就這一點(diǎn)，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次印證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。譚曉冬等[26]通過利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法確定PC-1.0和PC-1細(xì)胞中Tjp-2的細(xì)胞內(nèi)定位變化的研究，結(jié)果表明 Tjp-2蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位變化參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞解離，就此推測阿司匹林可能通過影響腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5的細(xì)胞內(nèi)定位變化以達(dá)到防治結(jié)腸癌的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，阿司匹林能夠降低結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2中Lgr5基因表達(dá)，同時影響Lgr5蛋白的亞細(xì)胞定位，從而抑制了腫瘤干細(xì)胞增殖，以實(shí)現(xiàn)防治結(jié)腸癌的作用，表明Lgr5可作為抗結(jié)腸癌靶向治療的潛在新靶點(diǎn)。然而阿司匹林對COX-2不同程度表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞株中的Lgr5均有抑制作用，表明了阿司匹林防治結(jié)腸癌的進(jìn)一步機(jī)制主要涉及非COX-2途徑。關(guān)于腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)gr5與非COX-2途徑的具體關(guān)聯(lián)還尚不明確。此外，阿司匹林通過何種機(jī)制影響了Lgr5的細(xì)胞內(nèi)定位變化，這些都需進(jìn)一步深入研究。