薩日呼，烏力吉，解秀花，薩礎(chǔ)拉

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，呼和浩特 010110)

蒙藥蘇格木勒-3湯始載于《四部醫(yī)典》[1]，為蒙醫(yī)臨床常用主治失眠方劑，由白豆蔻15 g、香旱芹10 g、蓽茇5 g組成，其味辛，性溫，具有抑赫依作用。目前在臨床廣泛應(yīng)用于治療失眠癥等。課題組前期將蒙藥蘇格木勒-3湯分為水提物與揮發(fā)油部位進(jìn)行了廣泛地研究。在完成蘇格木勒-3水提物血清藥物化學(xué)研究的過程中筆者發(fā)現(xiàn)，口服蘇格木勒-3水提物后，大鼠血清中檢測到胡椒堿，且在大鼠腦組織中也檢測到了胡椒堿。目前已發(fā)現(xiàn)胡椒堿具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、鎮(zhèn)靜、抗驚厥[4]、抗抑郁[5]等諸多藥理作用。推測胡椒堿為蘇格木勒-3潛在的有效物質(zhì)，但是蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)特征尚未明確。因此，為了揭示蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)特征，并了解其體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄過程，且為蘇格木勒-3的進(jìn)一步開發(fā)研究提供科學(xué)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)。為此，本文首先建立胡椒堿的檢測方法，并將該法用于研究給予蘇格木勒-3水提物后大鼠體內(nèi)胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 胡椒堿對(duì)照品(批號(hào)：110775-201706，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；維拉帕米(批號(hào)：110788-201707，中國食品藥品檢定研究院，含量≥98%)；甲醇(批號(hào)：CAS67-56-1，含量≥99.9%)、乙腈(批號(hào)：LOT190882，含量≥99.9%)均為色譜純(Fisher)；水為純化水，其他試劑均為分析純。

蘇格木勒-3水提物、蓽茇水提物由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙藥炮制實(shí)驗(yàn)中心提供，蘇格木勒-3中各單味藥材：白豆蔻、香旱芹與蓽茇(內(nèi)蒙古天立藥材公司)。經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院圖門巴雅爾教授鑒定：白豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierreexGagnep和爪哇白豆蔻AmomumcompactumSoland.exMaton的果實(shí)(產(chǎn)地：廣西，安國路路通中藥飲片有限公司，批號(hào)：1606021)；白豆蔻含量符合《中華人民共和國藥典》2015年版的要求；香旱芹為傘形科植物孜然芹CuminumcyminumL.的成熟果實(shí)(產(chǎn)地：新疆，安國路路通中藥飲片有限公司，批號(hào)：150401)；蓽茇為胡椒科植物蓽茇(PiperlongumL.)的干燥未成熟或成熟的果穗(產(chǎn)地：湖南，安國路路通中藥飲片有限公司，批號(hào)：150401)；蓽茇符合《中華人民共和國藥典》2015年版的要求。

1.1.2儀器 Waters ACQUITY UPLC超高液相系統(tǒng)，Waters Xevo G2-XS Tof[沃特世科技(上海)有限公司]；Biofuge primo R臺(tái)式離心機(jī)(美國Thermo公司)；Sartorious BT 25S型1/100000電子分析天平(感量：0.001 mg，北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；GENIE微型旋渦混合儀(美國)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠6只，體質(zhì)量220～260 g，由北京海淀區(qū)興隆動(dòng)物實(shí)驗(yàn)繁殖中心提供，合格證編號(hào)：SCXK(蒙)2002-0001，飼養(yǎng)室相對(duì)濕度40%～50%，溫度(24±2) ℃，明暗12 h交替環(huán)境中適應(yīng)7 d。

1.2方法

1.2.1色譜條件 液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18(2.1 mm ×100 mm，1.8 μm)色譜柱(Waters公司)；流動(dòng)相甲醇(A)-0.1%甲酸水(B)。A：B=70%：30%。流速：0.4 mL· min-1。柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為：2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源ESI+，正離子模式檢測，多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，胡椒堿母離子m/z286，子離子m/z201，錐孔電壓80 V，碰撞電20 V。維拉帕米母離子m/z455，子離子m/z165，錐孔電壓80 V，碰撞電20 V。毛細(xì)管電壓2.98 kV，離子源溫度130 ℃，干燥器溫度449 ℃，干燥氣流速99 L· h-1。

1.2.2對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取胡椒堿對(duì)照品適量，甲醇溶解，配成20.36 μg·mL-1儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.3內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液的制備 精密稱取維拉帕米內(nèi)標(biāo)物適量，甲醇溶解，配成5.08 μg·mL-1的儲(chǔ)備液，置4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.4血清樣品的預(yù)處理 精密吸取內(nèi)標(biāo)物10 μL于具塞離心管中，加入大鼠血清樣品200 μL，加乙腈800 μL，渦旋5 min，12 000 r· min-1(r=0.25 cm)離心15 min，取上清液于40 ℃氮吹流吹干，殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，12 000 r· min-1離心15 min，進(jìn)樣分析。

1.2.5藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

①蘇格木勒-3水提物的制備 稱取備用的蘇格木勒-3湯(白豆蔻：香旱芹：蓽茇=3：2：1)50 g，加純化水1000 mL，煎煮30 min后，濾過，濾液蒸干，蘇格木勒-3得率為：18%。

②藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn) 取SD大鼠，給藥前禁食不禁水12 h，按臨床劑量40倍給藥灌胃給予蘇格木勒-3水提物3.96 g·kg-1，給藥后10，20，30 min，1，2，4，6，8，12，24 h由大鼠眼底靜脈叢采血約2 mL，3000 r·min-1(r=0.5 cm)離心15 min，分離血清，-80 ℃冷凍儲(chǔ)藏。

2 結(jié)果

2.1專屬性實(shí)驗(yàn) 空白血清、空白血清+胡椒堿、胡椒堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)物+空白血清、給藥后30 min的含藥血清多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖1。由圖1可知，血清中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾胡椒堿和內(nèi)標(biāo)物的測定。胡椒堿與內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為5.69和2.95 min。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血清，稀釋胡椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，按血清樣品處理方法操作，配制成相當(dāng)于胡椒堿為20.272，10.136，5.068，2.534，1.267，0.633 5，0.032，0.015 μg ·mL-1的血清對(duì)照樣品溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以胡椒堿濃度為橫坐標(biāo)，以胡椒堿與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為：Y=0.087 1X+0.005 8，R2=0.999 4，胡椒堿在0.015～20.272 μg·mL-1線性良好。胡椒堿的定量下限為0.015 μg·mL-1

A.PCPA大鼠空白血清加胡椒堿對(duì)照品；B.胡椒堿對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)+空白血清；C.蘇格木勒-3水提物含藥血清樣品；1.維拉帕米；2.胡椒堿。

。

2.3準(zhǔn)確度與精密度考察 取空白血清按“標(biāo)準(zhǔn)曲線制備”項(xiàng)下的方法分別制備低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)質(zhì)量控制樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行6個(gè)樣本分析，連續(xù)測定3 d，求得方法的準(zhǔn)確度與精密度(RSD)[6]，結(jié)果見表1。

表1 大鼠血清中胡椒堿準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4基質(zhì)效應(yīng) 精密加入低、中、高濃度對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，復(fù)溶到100 μL，渦旋3 min，12000 r·min-1(r=0.25 cm)，離心15 min，按“2.1”色譜條件下進(jìn)行測定，峰面積為A1，按“2.4”項(xiàng)下方法提取空白血清，離心濃縮后同法操作，峰面積為A2，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，公式為基質(zhì)效應(yīng)=A2/ A1×100%，結(jié)果見表1，可知內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)胡椒堿無影響。

2.5胡椒堿提取回收率 在空白血清中加入已知量的胡椒堿對(duì)照品，制成低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的質(zhì)量控制樣品，進(jìn)行樣品處理，測定。另取空白血清樣品，樣品處理，離心后得上清液，分別加入上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，經(jīng)過處理后測定。以2種方法測得的胡椒堿峰面積比值計(jì)算提取回收率，回收率為70% ～85%。

2.6胡椒堿穩(wěn)定性考察 在空白血清中加入已知量的胡椒堿對(duì)照品，制成低、中、高濃度(胡椒堿0.39，0.03，0.015 μg·mL-1)的質(zhì)量控制樣品各3樣本，考察樣品在室溫放置24 h、-20 ℃保存30 d，經(jīng)歷3個(gè)冷凍-解凍循環(huán)下的穩(wěn)定性[7]，結(jié)果表明胡椒堿在上述條件下均穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

2.7蘇格木勒-3水提物中胡椒堿大鼠血清藥動(dòng)學(xué)研究 取“1.2.4”項(xiàng)下制備血清樣品，在擬定色譜條件下進(jìn)樣分析。以血藥濃度對(duì)時(shí)間作圖，采用藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)胡椒堿在大鼠體內(nèi)的血藥濃度時(shí)間曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖2，其主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

表2 大鼠血清中胡椒堿穩(wěn)定性考察

表3 蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

圖2 大鼠血清中胡椒堿藥物濃度-時(shí)間曲線

3 討論

近幾年來，胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較多，鐘峰等[8]采用HPLC法測定了大鼠血漿中胡椒堿的血藥濃度并進(jìn)行了藥動(dòng)學(xué)研究。當(dāng)HPLC法測定血漿中藥物成分濃度時(shí)，缺點(diǎn)在于靈敏度較低，無法測得血藥濃度較低樣品，從而影響了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。因此，本文采用UPLC-Q-TOF法測定了胡椒堿的血藥濃度。實(shí)驗(yàn)比較了胡椒堿在正離子和負(fù)離子兩種檢測方式下的響應(yīng)，結(jié)果用負(fù)離子檢測時(shí)胡椒堿信號(hào)響應(yīng)很弱，而采用正離子檢測則信號(hào)強(qiáng)度較大，故選擇了在正離子模式下測定。

本文在考察血清樣品處理方法時(shí)選用了固相萃取與有機(jī)溶劑除去蛋白的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈除蛋白的預(yù)處理效果較好。在選用乙腈除蛋白的方法時(shí)，又考察了血清樣品與乙腈比例1：2、1：3、1：4時(shí)除蛋白效果，1：4時(shí)除蛋白效果最好。

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明：蘇格木勒-3水提物中胡椒堿在正常大鼠體內(nèi)血藥濃度于4 h內(nèi)才達(dá)到峰值，半衰期也較長。下一步，筆者將與蓽茇單藥中胡椒堿的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。綜上所述，本文揭示了蘇格木勒-3水提物中胡椒堿的藥動(dòng)學(xué)特征，為其進(jìn)一步開發(fā)研究提供了科學(xué)的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)。