傅 強(qiáng),王偉佳,黃福達(dá),繆麗韶，楊山虹，陳 康

中山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東中山 528403

銅綠假單胞菌是廣泛分布于自然界的細(xì)菌，是引起慢性感染和醫(yī)院感染常見的病原體之一，可引起尿路感染、肺部感染、皮膚感染、角膜感染等[1-2]。天然免疫和參與天然免疫的初始免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)是病原體感染時(shí)發(fā)揮免疫防御作用的第一道防線。病原體感染啟動機(jī)體的炎性反應(yīng)，激活的炎性反應(yīng)可以促進(jìn)病原體的清除，然而，過度的炎性反應(yīng)會造成機(jī)體的免疫病理損傷[1-2]。因此，如何發(fā)揮機(jī)體的免疫防御功能，同時(shí)抑制過度炎性反應(yīng)造成的病理損傷在感染性疾病中至關(guān)重要。

β-catenin是經(jīng)典Wnt通路中的核心分子，當(dāng)Wnt信號通路被激活后，β-catenin在胞漿中聚集并轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種病理、生理過程。有研究報(bào)道，β-catenin可在自身免疫性疾病[3]、炎癥相關(guān)的疾病[4-5]及多種病原體感染[6-7]中發(fā)揮重要的免疫調(diào)控作用。在以往研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)感染銅綠假單胞菌時(shí)，β-catenin會抑制角膜的炎性反應(yīng)[6]。然而，β-catenin在銅綠假單胞菌感染中的免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚。凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是科學(xué)家于90年代發(fā)現(xiàn)的有絲分裂原激酶(MAPK)上游的信號分子，通過調(diào)節(jié)c-Jun氨基末端激酶(JNK)MAPK和P38 MAPK參與天然免疫調(diào)控和炎癥性疾病[8-11]。β-catenin通過ASK1調(diào)節(jié)P38在內(nèi)毒素血癥中發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用[12]。那么，ASK1在銅綠假單胞菌感染中的作用如何，β-catenin是否通過ASK1在銅綠假單胞菌感染中發(fā)揮免疫調(diào)控作用還有待于進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞、過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和對照細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃ 5%二氧化碳(CO2)條件下培養(yǎng)[6]。ASK1質(zhì)粒購自addgene公司，按照說明書采用陽離子脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染，以5 μg的終濃度應(yīng)用于細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)回復(fù)實(shí)驗(yàn)。siASK1購自Santacruz公司，按照說明書采用陽離子脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染，以5 μmol/L的終濃度應(yīng)用于細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 采用TRIzol法提取細(xì)胞的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，UVP成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增條帶。ASK1的引物序列見表1。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR) 采用TRIzol法提取細(xì)胞的RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用SYBR Green按照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time PCR。擴(kuò)增結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析細(xì)胞中白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-1β的基因表達(dá)。IL-6、IL-1β和β-actin的引物序列，見表1。

表1 引物序列

1.4Western-blot 收集細(xì)胞的蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜上，分別孵育5%脫脂奶粉、ASK1(1∶1 000)的一抗、抗兔二抗。經(jīng)曝光后觀察目的蛋白的水平。

1.5銅綠假單胞菌角膜炎動物模型的構(gòu)建 銅綠假單胞菌角膜炎動物模型構(gòu)建參考以往研究[6]。簡述如下：選取6～8周齡雌性SPF級C57BL/6小鼠20只，麻醉后劃傷左眼角膜并滴加銅綠假單胞菌菌液，構(gòu)建角膜炎模型。分別于1、3、5 d觀察角膜的渾濁程度和范圍，進(jìn)行臨床評分，并于感染5 d拍攝角膜的裂隙燈照片。臨床評分標(biāo)準(zhǔn)：0級，角膜清澈或輕度渾濁；+1級，角膜輕度渾濁，部分或完全遮蓋眼前段；+2級，角膜中度渾濁，完全遮蓋眼前段；+3級，角膜高度渾濁，完全遮蓋眼前段；+4級，角膜潰瘍穿孔。結(jié)膜下注射siASK1和siNC以10 μmol/L的終濃度應(yīng)用于動物模型，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1β-catenin抑制ASK1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá) 為了探討β-catenin抑制銅綠假單胞菌感染誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)的機(jī)制，在過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和對照細(xì)胞中檢測差異表達(dá)的mRNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)β-catenin可以抑制ASK1 轉(zhuǎn)錄水平，與對照組相比，ASK1 mRNA水平降低了2.6倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。采用PCR和Wester-blot的方法進(jìn)一步驗(yàn)證ASK1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)β-catenin明顯抑制了ASK1轉(zhuǎn)錄水平(圖1A)和蛋白(圖1B)的表達(dá)。

注：在過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和對照細(xì)胞中采用普通PCR的方法(A)和Western-blot的方法(B)檢測ASK1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的表達(dá)。

2.2沉默ASK1抑制銅綠假單胞菌感染后的炎癥因子的表達(dá) ASK1作為調(diào)節(jié)天然免疫和炎性反應(yīng)的重要分子，在銅綠假單胞菌感染中的作用還未知。為了探討ASK1在銅綠假單胞菌感染中的免疫調(diào)控作用，本文應(yīng)用ASK1的siRNA在轉(zhuǎn)錄水平沉默ASK1基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌感染后，沉默ASK1可以抑制炎癥因子IL-6(圖2A)和IL-1β(圖2B)基因水平的表達(dá)。

注：在RAW264.7細(xì)胞中采用陽離子脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染siASK1沉默ASK1的表達(dá)，與對照組siNC轉(zhuǎn)染組相比，在銅綠假單胞菌感染前后，采用Real-time PCR的方法檢測炎癥因子IL-6(A)和IL-1β(B)的表達(dá)；數(shù)據(jù)來源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，用來表示，***P<0.001。0 h和6 h分別表示銅綠假單胞菌未感染及感染后6 h。

2.3沉默ASK1抑制銅綠假單胞菌感染的角膜炎性反應(yīng) 銅綠假單胞菌角膜炎是急性化膿性角膜炎，該病的致病機(jī)制主要是由過度炎性反應(yīng)造成的免疫病理損傷。為了進(jìn)一步確認(rèn)ASK1在銅綠假單胞菌感染誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中的調(diào)控作用，構(gòu)建銅綠假單胞菌角膜炎的動物模型，沉默ASK1觀察疾病變化。臨床評分結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默ASK1后，在感染后3 d和5 d，臨床評分降低(圖3A)。裂隙燈結(jié)果顯示，沉默ASK1后角膜重度渾濁覆蓋眼前端，臨床評分為+3(圖3C)，而對照組角膜潰瘍穿孔，臨床評分為+4(圖3B)。Real-time PCR結(jié)果顯示，在銅綠假單胞菌感染5 d后，沉默ASK1可以抑制IL-6(圖3D)和IL-1β(圖3E)的表達(dá)。應(yīng)用銅綠假單胞菌角膜炎的動物模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證沉默ASK1可以抑制銅綠假單胞菌感染引起的炎性反應(yīng)。

注：構(gòu)建銅綠假單胞菌角膜炎動物模型，根據(jù)角膜的炎癥程度和炎癥的浸潤范圍判斷臨床評分(A)，實(shí)驗(yàn)組和對照組各10只小鼠，*P<0.05，**P<0.01；拍攝siASK1處理后銅綠假單胞菌感染5 d小鼠角膜(C)和對照組小鼠角膜(B)；采用Real-time PCR，在角膜炎5 d檢測siASK1和對照組siNC組小鼠角膜IL-6(D)和IL-1β(E)的表達(dá)；數(shù)據(jù)來源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，用來表示，*P<0.05，**P<0.01。

2.4β-catenin通過ASK1抑制銅綠假單胞菌引起的炎性反應(yīng) 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-catenin可在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平抑制ASK1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)沉默ASK1可在銅綠假單胞菌感染的體內(nèi)外模型中抑制炎性反應(yīng)。那么，β-catenin是否通過抑制ASK1發(fā)揮免疫調(diào)控功能呢？實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)β-catenin的同時(shí)過表達(dá)ASK1可減弱炎癥因子IL-6(圖4A)和IL-1β(圖4B)表達(dá)的抑制作用。

注：在過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞和對照RAW264.7細(xì)胞中采用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染ASK1質(zhì)粒，上調(diào)ASK1的表達(dá)，在銅綠假單胞菌感染前后，采用Real-time PCR的方法檢測炎癥因子IL-6(A)和IL-1β(B)的表達(dá)；數(shù)據(jù)來源于3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，用來表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討 論

Wnt/β-catenin是進(jìn)化高度保守的信號通路，β-catenin是經(jīng)典Wnt通路中核心分子。當(dāng)通路被激活時(shí)，β-catenin轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)下游基因的表達(dá)，參與多種生理和病理過程[3-7]。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌感染時(shí)，β-catenin抑制感染細(xì)胞和角膜的炎性反應(yīng)[6]。然而，β-catenin在通路假單胞菌感染中的免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

ASK1是免疫調(diào)控的重要分子，可通過JNK MAPK和P38 MAPK參與天然免疫調(diào)控和炎癥性疾病[8-9]。有研究報(bào)道，在幽門螺桿菌感染時(shí)，ASK1參與細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)，從而參與胃癌的發(fā)生[10]；愛德華菌屬中的新型毒素可通過ASK1-MAPK通路促進(jìn)疾病的發(fā)生[11]。然而，ASK1在銅綠假單胞菌感染中的免疫調(diào)節(jié)作用還未知。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅綠假單胞菌感染的細(xì)胞模型和動物模型中，沉默ASK1可在細(xì)胞模型和動物模型中抑制炎性反應(yīng)。

有研究報(bào)道，在內(nèi)毒素血癥中，β-catenin可抑制ASK1-P38信號通路，抑制內(nèi)毒素引起的炎性反應(yīng)[12]；在脆弱擬桿菌腸毒素刺激下，β-catenin通過抑制NF-κB的活性抑制IL-8的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)[13]；在化學(xué)劑硫酸吲哚酚誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，β-catenin可通過抑制巨噬細(xì)胞向M1極化抑制炎性反應(yīng)[14]；在腎臟炎性反應(yīng)中，β-catenin通過與Foxo相互作用誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg轉(zhuǎn)化，抑制腎臟纖維化和炎性反應(yīng)[15]。然而，在銅綠假單胞菌感染中，β-catenin調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin可以在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平抑制ASK1的表達(dá)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ASK1可減弱β-catenin對炎癥的抑制作用。這些結(jié)果提示，β-catenin通過調(diào)控ASK1抑制銅綠假單胞菌感染誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)β-catenin的RAW264.7細(xì)胞中ASK1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平明顯降低；沉默ASK1可在銅綠假單胞菌感染的細(xì)胞模型和動物模型中抑制炎性反應(yīng)；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASK1可減弱β-catenin對炎癥的抑制作用。綜上所述，β-catenin通過調(diào)控ASK1抑制銅綠假單胞菌感染引起的炎性反應(yīng)。