盧志宇，閆 鑫，于永慧，丁 晟，夏光輝，周冬生，熊小路，徐建民，焦 俊

立克次體為專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性小球桿菌，其引起的立克次體病是重要的人獸共患自然疫源性疾病[1]。立克次體病原體主要有斑疹傷寒群立克次體(typus-group rickettsiae)、斑點(diǎn)熱群立克次體(spotted fever group rickettsia, SFGR)、恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi)、無形體(Anaplasma)和埃立克體(Ehrlichia)等，分別引起斑疹傷寒、斑點(diǎn)熱、恙蟲病、無形體病和埃立克體病。貝氏柯克斯體(Coxiellaburnetii)雖然已歸類到軍團(tuán)菌目，但其引起的Q熱仍歸于立克次體病范疇。在自然環(huán)境中，哺乳動(dòng)物，尤其是嚙齒類動(dòng)物是多種立克次體的自然宿主[2]，也是蜱、螨等立克次體傳播媒介的自然吸血宿主[3-4]，在立克次體病的流行中起重要作用。

近年來，國(guó)內(nèi)立克次體宿主學(xué)研究集中于立克次體節(jié)肢動(dòng)物傳播媒介—蜱，發(fā)現(xiàn)蜱可攜帶斑點(diǎn)熱群立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)、查菲埃立克體(Ehrlichiachaffeensis)、貝氏柯克斯體等[5-6]。而嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體的研究數(shù)據(jù)相對(duì)較少，文獻(xiàn)報(bào)告多在我國(guó)東北林區(qū)、新疆戈壁、云南熱帶雨林、南海島礁等遠(yuǎn)離密集人群地區(qū)發(fā)現(xiàn)嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體[7-15]。

江西省位于我國(guó)東南部，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，當(dāng)?shù)厮W(wǎng)稠密，是以水稻為主的重要糧食產(chǎn)區(qū)之一，同時(shí)也是鼠類等嚙齒動(dòng)物密集活動(dòng)的重災(zāi)區(qū)[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)江西省部分地區(qū)的嚙齒類動(dòng)物攜帶鉤端螺旋體等病原[17]，但是罕見境內(nèi)嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體病原體報(bào)告。本研究選擇江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)捕獲嚙齒類動(dòng)物，采用立克次體屬/群特異性巢式PCR對(duì)嚙齒類動(dòng)物脾臟組織DNA樣本擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增的陽(yáng)性DNA片段測(cè)序和序列分析，旨在調(diào)查此地區(qū)嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體病原的種類，以便為當(dāng)?shù)亓⒖舜误w病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2019年10月，選擇江西省東、南、西、北的南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)(圖1)，在上述地區(qū)稻田布置中型板夾，采取夜夾法捕獲嚙齒類動(dòng)物。每個(gè)采集點(diǎn)每次放置有效鼠夾≥300個(gè)，行距30 m，夾距5 m[18]。下午或傍晚放夾，次日凌晨收夾。

圖1 在江西省的6個(gè)縣捕獲嚙齒動(dòng)物樣本

1.2 樣本處理及鼠種鑒定 將捕獲的嚙齒類動(dòng)物用75%酒精擦拭體表，于生物安全柜內(nèi)無菌解剖，取脾臟，將脾臟置液氮罐中凍存?zhèn)溆谩２东@的嚙齒類動(dòng)物通過形態(tài)學(xué)[19]及分子生物學(xué)方法進(jìn)行種類鑒定，分子生物學(xué)種類鑒定基于嚙齒動(dòng)物特異的線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(COI)[20]和細(xì)胞色素b(Cytb)基因[21]。

1.3 DNA提取和巢式PCR擴(kuò)增 從液氮中取脾臟，無菌剪取約100 mg脾臟組織置于無菌陶珠管中，加入300 μL PBS緩沖液后置于全自動(dòng)組織勻漿儀7 000 r/min勻漿90 s。充分勻漿后，取適量提取全基因組DNA，其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?。使用核酸提取試劑?Dneasy Blood&Tissue Kit，Qiagen)，按其說明書從脾臟勻漿液中提取DNA。

從文獻(xiàn)獲取擴(kuò)增柯克斯體16SrRNA基因[22]、斑點(diǎn)熱群立克次體ompA基因[4]、東方體56-kDa基因[23]和無形體和埃立克體16SrRNA基因[24]的屬/群特異性引物序列(表1)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以從鼠脾臟組織中提取的全DNA為模板，采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為50 μL：ddH2O 21 μL、2×PCR Premix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL，每次擴(kuò)增均設(shè)陰性(水)對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照(本實(shí)驗(yàn)室留存的立克次體全基因組DNA)。第2次擴(kuò)增時(shí)取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL為模板。電泳條件為1.5%的瓊脂糖凝膠120 V電壓下電泳20 min，加樣量5 μL/孔。2×PCR Premix和DNA Marker(DL 2000)為寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)，PCR儀(GeneAmp PCR System 9700)為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

表1 嚙齒動(dòng)物種類鑒定和立克次體特異性PCR擴(kuò)增引物

1.4 同源性比較和聚類分析 將巢式PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性DNA片段物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)中的BLAST界面與GenBank注冊(cè)基因進(jìn)行同源性比對(duì)，最后用MEGA 7.0軟件采用最大似然法(Maximum Likelihood)將新測(cè)得的基因序列與相關(guān)已知同源序列構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(Bootstrap值設(shè)定為1 000)。

2 結(jié) 果

2.1 樣本采集和鼠種鑒定 從江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)等地區(qū)的稻田，通過夜夾法共捕獲嚙齒類動(dòng)物393只，形態(tài)學(xué)鑒定為黑線姬鼠、褐家鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、社鼠和鼩鼱6個(gè)種類，并進(jìn)一步通過分子生物學(xué)方法確證。其中黑線姬鼠為優(yōu)勢(shì)鼠種，共計(jì)311只(79.14%)(表2)。

表2 采集的嚙齒動(dòng)物種類及數(shù)量(%)

2.2 巢式PCR檢測(cè) 采用柯克斯體屬、斑點(diǎn)熱群、東方體屬、無形體屬特異性引物對(duì)動(dòng)物DNA樣本做巢式PCR擴(kuò)增。結(jié)果從19只黑線姬鼠樣本擴(kuò)增出柯克斯體屬DNA(6.11%)，2只黑線姬鼠樣本擴(kuò)增出東方體DNA(0.64%)，從1只黑線姬鼠樣本擴(kuò)增出斑點(diǎn)熱群立克次體DNA(0.32%)，從所有黑線姬鼠樣本中未擴(kuò)增出無形體DNA，詳見表3。其它5種嚙齒類動(dòng)物樣本所有立克次體引物擴(kuò)增均為陰性。

表3 PCR檢出黑線姬鼠的陽(yáng)性結(jié)果

2.3 同源性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析 將擴(kuò)得的柯克斯體屬16SrRNA基因片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示19份樣本測(cè)得的基因序列一致，同源性分析顯示與已知貝氏柯克斯體16SrRNA基因同源性為98.43%～100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該菌株與Coxiellaburnetiistr.Schperling(CP014563.1)、CoxiellaburnetiiMSU Goat Q177(CP018150.1)、CoxiellaburnetiiCbuK Q154(CP001020.1)處于同一進(jìn)化分支(圖2)。

圖中菌株序列取自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，JX/2019/China為本研究中擴(kuò)得序列。

將擴(kuò)得的斑點(diǎn)熱群立克次體ompA基因片段測(cè)序，同源性分析顯示其與已知新塔拉薩維奇立克次體(CandidatusR.tarasevichiae)的ompA基因序列同源性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明該菌株與我國(guó)東北地區(qū)新塔拉薩維奇立克次體(MN450411.2，MN450410.2，MN450409.2，MG888729.1)處于同一進(jìn)化分支(圖3)。

圖中菌株序列取自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，JX-Fuliang/2019/China為本研究中擴(kuò)得序列。

將擴(kuò)得的東方體屬56-kDa基因片段測(cè)序，2份樣本基因序列一致，同源性分析顯示該序列與恙蟲病東方體的56-kDa基因序列同源性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該菌株與恙蟲病東方體(GU446598.1，JN415556.1，GQ332758.1，LC110350.1)處于同一進(jìn)化分支，為Gilliam基因型(圖4)。

圖中菌株序列取自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，JX/2019/China為本研究中擴(kuò)得序列。

3 討 論

既往調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，江西省嚙齒動(dòng)物攜帶有鼠疫耶爾森菌[25]、廣州管圓線蟲[26]、漢坦病毒[27]，鉤端螺旋體[15]等多種人獸共患病原或寄生蟲，但境內(nèi)嚙齒動(dòng)物攜帶立克次體鮮有報(bào)道。本次研究采用分子生物學(xué)方法對(duì)江西省南豐縣、銅鼓縣、上猶縣、浮梁縣、上高縣、上饒市廣信區(qū)的嚙齒類動(dòng)物攜帶立克次體的情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)黑線姬鼠攜帶貝氏柯克斯體、新塔拉薩維奇立克次體和恙蟲病東方體。

貝氏柯克斯體是重要的人獸共患病—Q熱的病原體。本次研究在江西省北部的浮梁縣、銅鼓縣以及東北部的上饒市廣信區(qū)的黑線姬鼠檢出貝氏柯克斯體，陽(yáng)性率為6.11%，提示這些地區(qū)存在Q熱的疫源地，黑線姬鼠是該疫源地貝氏柯克斯體的儲(chǔ)存宿主和潛在的Q熱傳染源。盡管江西目前尚未見Q熱疫情報(bào)告，但仍有必要對(duì)當(dāng)?shù)嘏R床不明原因發(fā)熱患者進(jìn)行Q熱篩查。

新塔拉薩維奇立克次體是斑點(diǎn)熱群的一新種，于2001年首先在俄羅斯烏拉爾南部和西部、西伯利亞東部的全溝硬蜱(Ixodespersalcatus)中發(fā)現(xiàn)[28]，隨后我國(guó)黑龍江、吉林、河南的全溝硬蜱中也檢出該立克次體[29]，王寧等[30]在內(nèi)蒙西部的長(zhǎng)爪沙鼠及五趾跳鼠也檢出該立克次體。另外，賈娜等于2012年在我國(guó)黑龍江牡丹江地區(qū)，首次從患者血樣本分離到新塔拉薩維奇立克次體，證實(shí)該立克次體可感染人[31]。本次研究中，我們從浮梁縣1只黑線姬鼠樣本中檢出該立克次體，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示該立克次體與我國(guó)黑龍江、吉林等地蜱中檢出的新塔拉薩維奇立克次體處于同一分支，提示除長(zhǎng)爪沙鼠及五趾跳鼠外，黑線姬鼠也是新塔拉薩維奇立克次體的宿主。此外，該地區(qū)的蜱是否也攜帶該立克次體和當(dāng)?shù)厝巳褐惺欠翊嬖诎唿c(diǎn)熱感染值得進(jìn)一步研究。

恙蟲病東方體是我國(guó)廣泛分布的重要人獸共患病病原，其自然界儲(chǔ)存宿主主要為鼠類動(dòng)物，恙螨為其傳播媒介[32]。1998年廖如桂等利用間接免疫熒光法確診了江西首例恙蟲病病例，隨后贛州、撫州等市縣也有恙蟲病散發(fā)病例報(bào)告[33]，2006-2018年江西省部分縣市恙蟲病的年均發(fā)病率超過了0.98/10萬[34]。本次調(diào)查在江西省浮梁縣和南豐縣的黑線姬鼠中檢出恙蟲病東方體，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示這2株恙蟲病東方體均屬Gilliam型，該型是我國(guó)主要的流行株，提示這兩個(gè)縣存在恙蟲病的自然疫源地。

江西是一個(gè)動(dòng)植物種類繁多、植被覆蓋率高、山清水秀的生態(tài)秀麗的省份，世界性分布的立克次體病原體也可在這種自然環(huán)境中循環(huán)。采用分子生物學(xué)方法，調(diào)查自然環(huán)境中的立克次體的宿主和傳播媒介，將發(fā)現(xiàn)立克次體病的自然疫源地，將為有效防控人群的立克次體感染提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無