伍錦鳳, 桂照華, 閆 紅

(1. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院 臨床病理中心, 安徽 合肥, 230036;2. 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)智慧病理學(xué)研究所, 安徽 合肥, 230036)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤[1], 其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第一，嚴(yán)重威脅女性健康。人表皮生長因子受體-2(HER2)定位于17q21，屬于原癌基因，可促進(jìn)腫瘤新生血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力，并可作為預(yù)測乳腺癌預(yù)后的可靠依據(jù)[2]。20%～30%的原發(fā)性乳腺癌患者存在HER2基因的擴(kuò)增[3], 這部分患者預(yù)后差、內(nèi)分泌治療和化療反應(yīng)差，但靶向治療如曲妥珠單抗(赫賽汀)對其療效很好。因此，評估HER2基因的擴(kuò)增和蛋白表達(dá)情況對乳腺癌患者的預(yù)后評估及治療有重要價值。本研究探討乳腺癌組織中HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增的一致性及臨床意義，并分析HER2基因擴(kuò)增與臨床病理特征的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年2—12月收治的101例乳腺癌患者，樣本包括手術(shù)切除85例、手術(shù)旋切3例及穿刺活檢13例。病理類型: 浸潤性導(dǎo)管癌92例，浸潤性小葉癌7例，浸潤性小管癌1例，浸潤性髓樣癌1例。101例患者均為女性，術(shù)前未接受其他臨床治療，年齡31～77歲，所有的病例標(biāo)本均在離體60 min內(nèi)用10%中性福爾馬林固定，固定后石蠟包埋，切片厚度為3～5 μm。

1.2 方法

1.2.2 免疫組化(IHC)法: 新鮮癌組織手術(shù)后60 min內(nèi)用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切取3 μm厚切片。IHC步驟為切片后使用Roche Ventana Benchmark XT全自動免疫組化儀自動熱修復(fù)，采用Ventana專業(yè)修復(fù)液CC1, pH 值8.2, 100 ℃修復(fù)30 min, 手工加HER2兔抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司), 37 ℃孵育28 min, DAB顯色，顯微鏡下觀察結(jié)果。所有試驗均設(shè)陰陽性對照。IHC結(jié)果判讀依據(jù)《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》[4], 0(-)為無著色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞顯示不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色; (+)為>10%的浸潤癌細(xì)胞顯示不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色; ()為>10%的浸潤癌細(xì)胞顯示弱～中等強(qiáng)度的完整細(xì)胞膜染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜染色; ()為>10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)、完整且均勻的細(xì)胞膜染色。

1.2.2 熒光原位雜交法(FISH): FISH切片制備方法同IHC法，切取4 μm切片于65 ℃烤箱內(nèi)過夜, FISH步驟為切片置于全自動FISH前處理系統(tǒng)儀(武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司)中，進(jìn)行脫蠟、酶解消化; 滴加HER2基因擴(kuò)增檢測熒光原位雜交探針(武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司)，置入Hydridizer 原位雜交儀(丹麥, DAKO)雜交2 h, 復(fù)染DAPI后置于OLYMPAS BX53熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。FISH結(jié)果判讀依據(jù)《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》[4], 選擇細(xì)胞核大小一致且核完整、DAPI染色均勻、信號清晰的腫瘤細(xì)胞判讀。隨機(jī)計數(shù)至少20個浸潤癌細(xì)胞核中的雙色信號: ① HER2/CEP17≥2.0, 平均 HER2 拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥4.0, 判為陽性。若HER2信號成簇時直接判為陽性。② HER2/CEP17≥2.0, 平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)<4.0，判為陰性。③ HER2/CEP17<2.0, 平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥6.0, 判為陽性。④ HER2/CEP17<2.0, 平均 HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥4.0且<6.0, 若IHC結(jié)果為(), 判為陽性; 若IHC結(jié)果為0、(+)或(), 應(yīng)判為陰性。⑤ HER2/CEP17 <2.0, 平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)<4.0, 判為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，應(yīng)用FISHER精確檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IHC法檢測HER2蛋白表達(dá)情況

本實驗選取的浸潤性乳腺癌標(biāo)本101例，其中HER2蛋白表達(dá)13例為(), 所占比例為12.87%; 81例為(), 所占比例為80.20%; 6例為(+), 所占比例為5.94%; 陰性為1例，所占比例0.99%(見圖1)。

A: HER2蛋白表達(dá)(-);

B: HER2蛋白表達(dá)(+);

C: HER2蛋白表達(dá)();

D: HER2蛋白表達(dá)()。

2.2 FISH法檢測HER2基因擴(kuò)增情況

本實驗選取的浸潤性乳腺癌標(biāo)本101例, HER2基因無擴(kuò)增的為75例，占比為74.26%, 其中7例HER2拷貝數(shù)為4～6, HER2/CEP17<2.0，結(jié)果判斷為不確定，根據(jù)《乳腺癌HER2檢測指南(2019版)》，此7例患者免疫組化均為(), 故結(jié)合免疫組化結(jié)果均判為HER2基因無擴(kuò)增，其余68例為HER2/CEP17<2.0, 且HER2拷貝數(shù)<4.0; HER2基因擴(kuò)增的為26例，占比為25.74%, 其中20例為多點狀或簇狀擴(kuò)增, 5例為HER2/CEP17>2.0, 1例為HER2/CEP17<2.0, 但HER2拷貝數(shù)為7.4>6.0。見圖2。

A: FISH檢測腫瘤細(xì)胞中HER2信號呈簇狀擴(kuò)增，HER2基因擴(kuò)增(+);

B: FISH檢測腫瘤細(xì)胞中HER2與CEP17信號的比值<1.8, 平均HER2拷貝數(shù)/細(xì)胞<4.0，HER2基因擴(kuò)增(-)。

2.3 HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增的相關(guān)性

對比研究HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增的相關(guān)性, HER2蛋白(-)的1例基因無擴(kuò)增(100%), HER2蛋白(+)的6例基因均無擴(kuò)增(100%), HER2蛋白()的81例中14例有基因擴(kuò)增(17.28%), HER2蛋白()的13例中12例有基因擴(kuò)增(92.31%)。HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增具有較好的一致性(P<0.05), 見表1。

表1 HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增的相關(guān)性

2.4 HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)與患者的年齡具有相關(guān)性(P<0.05), 與患者腫瘤最大徑、腫瘤組織學(xué)分級、Ki67表達(dá)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均無相關(guān)性(P>0.05), 見表2。

表2 HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)與年齡、組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、Ki67及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

3 討 論

HER2編碼一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜生長因子受體, HER2基因的表達(dá)不僅與浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，更是評估臨床預(yù)后和指導(dǎo)用藥的重要指標(biāo)[5]。目前，曲妥珠單抗是食品及藥物管理局(FDA)認(rèn)證的第一種治療乳腺癌的靶向藥物。曲妥珠單抗是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，能特異性地作用于HER2過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞，降低乳腺癌復(fù)發(fā)率及病死率，提高生存率，明顯改善患者預(yù)后。曲妥珠單抗的應(yīng)用前提為HER2 IHC()或FISH檢出基因擴(kuò)增，由于其價格昂貴，且乳腺癌化療藥物存在心臟毒性風(fēng)險[6]，因此為了能夠采取適當(dāng)治療方法，HER2狀態(tài)檢測已成為乳腺癌患者治療前的基本程序。

目前FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床檢測HER2狀態(tài)的方法有2種，分別為IHC檢測HER2的蛋白表達(dá)情況以及FISH檢測HER2的基因擴(kuò)增情況。IHC法操作簡便、費用低、技術(shù)掌握容易、對材料要求不高，是現(xiàn)在臨床最常用方法，但在標(biāo)本固定及處理中容易造成蛋白變性破壞，而抗原修復(fù)方法不同、不同批次抗體差異、結(jié)果判讀的主觀性等原因均會影響檢測結(jié)果[7]。FISH檢測核酸更加穩(wěn)定、量化，熒光信號點觀察直觀，相比IHC而言主觀性更弱，更加客觀，目前認(rèn)為FISH是檢測HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)的金標(biāo)準(zhǔn)[8]。研究[9-10]顯示, HER2免疫組化()的病例FISH的陽性率為78.2%～98.9%, HER2免疫組化()的病例FISH的陽性率為18%～44%, 故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為HER2()的患者必須做FISH檢測以明確其基因擴(kuò)增情況。本研究對101例乳腺浸潤性癌患者HER2狀態(tài)進(jìn)行IHC及FISH檢測，證實HER2蛋白表達(dá)(-)及(+)的病例，其基因無擴(kuò)增，兩者符合率為100%, 與以往學(xué)者[11]研究報道的符合率(100%)一致; HER2蛋白表達(dá)()與基因擴(kuò)增符合率為17.28%, 這與國外文獻(xiàn)[12-14]報道結(jié)果也比較接近，HER2蛋白表達(dá)()的與基因擴(kuò)增符合率為92.3%。本研究結(jié)果顯示，IHC檢測HER2蛋白表達(dá)和FISH檢測HER2基因擴(kuò)增之間有相關(guān)性(P<0.05)，表明HER2蛋白著色越強(qiáng)，其基因擴(kuò)增的可能性越大，提示HER2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增緊密相關(guān)。本研究還證實乳腺癌患者HER2基因擴(kuò)增與腫瘤的組織學(xué)分級、腫瘤最大徑、Ki67表達(dá)及患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性(P>0.05), 但與患者年齡有相關(guān)性(P<0.05), 患者年齡越小, HER2基因的擴(kuò)增率增高，表明越是年輕的患者其基因擴(kuò)增的可能性越高，預(yù)后可能越差，更需要進(jìn)行基因檢測。本研究中還發(fā)現(xiàn)了9例17號染色體多體，目前在乳腺癌中17號染色體非整體性，即每個細(xì)胞17號染色體數(shù)目大于(多體性)或小于(單體性或亞二體性)2個，是乳腺癌的遺傳學(xué)特征之一。研究[15-18]表明，在乳腺癌中占有相當(dāng)數(shù)量的此類患者，其臨床預(yù)后不同于無此異常者。

綜上所述，評估HER2蛋白表達(dá)或HER2基因擴(kuò)增情況對乳腺癌發(fā)生發(fā)展及治療有重要意義[19-20]。IHC及FISH結(jié)果存在較好的一致性, 2種方法相結(jié)合有利于評價HER2的結(jié)果及制定分子靶向治療方案，所有乳腺癌患者均應(yīng)進(jìn)行IHC檢測。FISH和IHC檢測結(jié)果的差異主要體現(xiàn)在HER2蛋白(), 故建議對HER2蛋白()的病例常規(guī)進(jìn)行FISH檢測, IHC()也存在個別基因不擴(kuò)增的情況，文獻(xiàn)[14]報道免疫組化(+)組也存在基因擴(kuò)增的情況，所以如果經(jīng)濟(jì)條件允許，應(yīng)對所有乳腺浸潤性癌患者進(jìn)行HER2的FISH檢測，并加強(qiáng)質(zhì)量控制。