王玉明 李賀

變應(yīng)性鼻炎（AR）是一種由IgE 介導(dǎo)的鼻部癥狀性疾病，其特征是鼻癢、打噴嚏、流清涕和鼻塞。是Th2 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化及其細(xì)胞因子過度表達(dá)引起的疾病[1]。Th 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子為T-bet 與GTAT-3，對(duì) Th1/Th2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)鍵性作用[2]，其在變應(yīng)性鼻炎患者中表達(dá)明顯增高[3]。轉(zhuǎn)錄因子T-bet 低表達(dá)和GATA-3 過表達(dá)之間，主要表現(xiàn)的是GATA-3 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，導(dǎo)致血漿中其相應(yīng)的細(xì)胞因子IFN-γ 的含量減少和IL-4 含量增多，呈現(xiàn)出鼻癢、噴嚏、清水鼻涕等變應(yīng)性鼻炎的臨床癥狀.AR 發(fā)生的基因基礎(chǔ)可能是GATA-3/T-bet 表達(dá)比例失衡，治療AR 的關(guān)鍵所在可能是糾正調(diào)節(jié)二者的比例失衡[4]。麻黃附子細(xì)辛湯源自張仲景的《傷寒雜病論論·辨少陰病脈證并治》[5]，是治療少陰病的效方。為少陰與太陽合病，外感之寒涼由太陽直透少陰所致反發(fā)熱，脈沉者，麻黃以解表寒，附子解里寒，佐以辛溫香竄之細(xì)辛，既能助附子解里寒，又能助麻黃以解外寒，俾其自太陽透入之寒，仍由太陽作汗而解。耳鼻喉科臨床上將此方應(yīng)用于虛寒型AR 治療效果可靠，是耳鼻喉學(xué)者公認(rèn)的有效方劑。《傷寒雜病論》中的經(jīng)典方配伍都非常嚴(yán)謹(jǐn)，藥味少而精。要開發(fā)經(jīng)方，深研其內(nèi)在作用機(jī)制，更準(zhǔn)確的指導(dǎo)和應(yīng)用于臨床實(shí)踐，研究者一是從實(shí)驗(yàn)的層面在基因分子作用機(jī)制上進(jìn)行深入探究，一是將在變應(yīng)性鼻炎的臨床應(yīng)用上進(jìn)行科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床觀察。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

挑選3 月齡清潔級(jí)的50 只健康豚鼠（供應(yīng)商：魯抗醫(yī)藥股份有限公司，合格證號(hào)為：SCXK 魯20B0001），體重約 250g 左右，雌雄各半，按照隨機(jī)表分法分為五組，每組各10 只。

1.2 所選實(shí)驗(yàn)藥物

治療藥物：麻黃附子細(xì)辛湯（由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供），組成：炮附子9g、麻黃6g、細(xì)辛3g。陽性對(duì)照藥物：地塞米松（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H37020290），山東新華制藥股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

豚鼠皮質(zhì)酮(CORT)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C80635-09）、豚鼠17-OHCS 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)O80152-09）、豚鼠可溶性免疫球蛋白A(SIGA)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)S80751-09）均由Scbt公司提供（分裝）；GATA-3 抗體免疫組化法批號(hào)：bs-1452R 生產(chǎn)廠家：北京博奧森；RT-PCR 試劑盒，批號(hào)：DRR047A，生產(chǎn)廠家：大連寶生物；GATA-3 引物、β-actin 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 肺氣虛寒模型及AR 模型的建立

2.2.1 肺氣虛寒模型建立

依據(jù)煙熏法[6]造模及樊雅莉等[7]虛寒證藥物造模的方法，先行虛寒癥造模：按照龍膽草∶石膏∶知母∶黃柏=1.2∶2∶1.5∶1 比例，加工成煎劑濃度為 200%，按照每天2 次，每次每只3ml 灌胃，從第17d 起改為每天3 次。用藥一共28d。從灌胃的第13d 起同時(shí)加用煙熏法進(jìn)行肺氣虛寒證候造模，連續(xù)進(jìn)行15d 煙熏：用特制玻璃煙熏造模箱，體積為80cm×50cm×50cm，河南南陽艾絨廠提供的長(zhǎng)120mm，內(nèi)含硫磺粉7g、艾絨30g 的特制煙熏艾條。每日上午10:00 及下午15:00 將豚鼠放入點(diǎn)燃艾條的煙熏箱，煙熏30min/次。共用時(shí)28d 完成肺氣虛寒證候造模。

2.2.2 AR 模型的建立

參考文獻(xiàn)造模方法[8，9]在肺氣虛寒證造模成功后行變應(yīng)性鼻炎造模：用1ml 生理鹽水將氫氧化鋁粉末30mg 及卵清蛋白（OVE）0.3mg 溶解制成均勻混懸液，隔日1 次，對(duì)大鼠腹腔注射做基礎(chǔ)致敏，共7 次。再以5%卵清蛋白(OVE)溶液滴雙側(cè)鼻腔，共7d，每天一次，每側(cè)50μL。最后一次滴鼻后記錄豚鼠1/2h 內(nèi)撓鼻、打噴嚏及流涕等癥狀，用疊加法來計(jì)算鼻炎的癥狀得分，評(píng)分大于5 則說明AR 模型造模成功。

3 麻黃附子細(xì)辛湯各拆方組和地塞米松對(duì)照組干預(yù)治療

3.1 麻附辛各拆方水煎液制備

各配伍拆方組：1 號(hào)組全方：麻黃、附子、細(xì)辛；2號(hào)組方：附子、麻黃；3 號(hào)組方：細(xì)辛、麻黃。原方：麻黃二兩去節(jié)，細(xì)辛二兩，附子一枚炮去皮破八片。將各組方的中藥飲片按照原方比例，遵循《方劑學(xué)》[10]中：“上三味，以水一斗，先煮麻黃，減二升，去上沫，內(nèi)諸藥，煮取三升，去滓”，把細(xì)辛、附子、麻黃的中藥飲片分別加水浸泡半h 后，先將麻黃煮20min，過程中隨時(shí)去除浮沫，再將泡好的細(xì)辛和附子加入一起煮30min，用4 層紗布進(jìn)行粗濾渣,其它各配伍拆方的煎法與此相同，煎煮的過程中要時(shí)刻冷凝回收氣體，各拆方組均以含麻黃生藥0.5g/ml 為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行水浴濃縮致各配伍拆方組中麻黃、附子、細(xì)辛的生藥質(zhì)量濃度與原方中各相應(yīng)生藥質(zhì)量濃度相同，把pH 值調(diào)為中性，用4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 干預(yù)治療

①模型組：按照以上方法造模成功后，恢復(fù)正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行其它干預(yù)處理。

②實(shí)驗(yàn)各拆方組：以臨床等效劑量換算至豚鼠用藥量，1～3 號(hào)拆方組按照 10mg/kg，從 AR 造模 8d起施以灌胃治療,各拆方組水煎液的具體用量如下：1 號(hào)拆方組：麻黃、附子、細(xì)辛，1.97g/KG；2 號(hào)拆方組：麻黃、附子，1.41g/KG；3 號(hào)拆方組：麻黃、細(xì)辛，1.12g/KG）每日灌胃用藥一次,連續(xù)應(yīng)用15d。

③地塞米松對(duì)照組：從AR 造模8d 起按照2mg/kg 給予地塞米松灌胃，每日灌胃用藥一次,連續(xù)應(yīng)用15d。

4 豚鼠行為觀察及指標(biāo)檢測(cè)

4.1 豚鼠模型行為學(xué)變化

4.1.1 肺氣虛寒模型豚鼠的行為學(xué)：觀察其癥狀表現(xiàn)：①氣短喘促；②咳嗽；③痰白清稀（口鼻四周分泌物）；④畏寒惡風(fēng)（蜷縮抱團(tuán)）；⑤毛發(fā)枯松沒有光澤；⑥神疲乏力（反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少）。記錄呼吸、脈搏、肛溫、尿量等定量指標(biāo)情況。

4.1.2 模型AR 疾病行為學(xué)：觀察豚鼠抓鼻、打噴嚏、流清涕等變應(yīng)性鼻炎發(fā)作時(shí)的癥狀。記錄最后一次用藥30min 內(nèi)癥狀評(píng)分，見表1。

表1 AR 癥狀記分

4.2 造模相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

虛寒證候指標(biāo)：血清皮質(zhì)醇(F)、尿17-OHCS 等定量指標(biāo)。

4.3 豚鼠鼻黏膜組織GATA-3mRNA 表達(dá)水平的半定量檢測(cè)

采用RT-PCR 方法測(cè)定GATA-3mRNA 的表達(dá)水平。TRIzol 法抽提鼻黏膜總RNA，經(jīng)純化、濃度測(cè)定后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此模板行PCR 擴(kuò)增，目的基因的引物序列：GATA -3 為上游 5’-TACCCTCCAGCCTCATCTTC -3’， 退 火 溫 度 為59.24℃，下游 5’-TCACACACTCCCTGCCTTCT-3’，退 火 溫 度 為 60.86℃ ，β -actin 上 游 5’-Tgc gTTACACCCTTTCTTgA-3’，退火溫度 55.8℃，下游5’-gTCACCTTCACCgTTCCAgT -3’， 退 火 溫 度59.8℃，將PCR Array 置于設(shè)置好的實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。采用2-△△CT 方法進(jìn)行結(jié)果分析。

4.4 用Western 蛋白印跡法檢測(cè)鼻黏膜組織中GATA-3 蛋白質(zhì)表達(dá)。

100mg 冷凍鼻黏膜組織中加入600ul 裂解液，冰上勻漿、超聲、靜置1h，4℃離心（150000r/min）15min，取上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將50ug 蛋白加入等體積的上樣緩沖液，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上；分別于GATA-3 和β-actin 單克隆抗體4℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG 抗體室溫孵育2h，ECL 發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，數(shù)碼曝光分析圖片。

結(jié)果

1 麻黃附子細(xì)辛湯及其拆方對(duì)豚鼠肺氣虛寒證候、AR 行為學(xué)指標(biāo)的影響，見表2-4。

表2 實(shí)驗(yàn)用藥后豚鼠虛寒癥、AR 行為學(xué)P 值

在造模過程中，五組豚鼠均出現(xiàn)喜蜷縮抱團(tuán)，活動(dòng)減少，食量減退，咳嗽及鼻周分泌物增多、鼻黏膜顏色潮紅，毛發(fā)枯槁成縷，體重增長(zhǎng)緩慢甚至不增長(zhǎng)。經(jīng)不同拆方組藥物干預(yù)后，麻附辛組、麻辛組、麻附組、地塞米松組虛寒癥相關(guān)指標(biāo)同干預(yù)前均有不同程度的改善，模型組與治療前比較無顯著性差異（P＞0.05）。在AR 行為學(xué)計(jì)分中，治療后各組對(duì)比，麻附辛組與地塞米松組的差異無顯著性（P＞0.05）而與其他組有差異（P＜0.05）。麻附組與麻辛組差異無顯著性（P＞0.05）。

表3 實(shí)驗(yàn)用藥前后豚鼠尿17- 羥皮質(zhì)醇（0HCS-17）P 值

實(shí)驗(yàn)后，各配伍拆方組豚鼠OHCS-17 較造模后表達(dá)增強(qiáng)，并與模型組具有顯著性差異（P＜0.05）。其中麻附辛組、麻附組、地塞米松組高表達(dá)，與其余組差異具有顯著性（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)后，各拆方組血清皮質(zhì)酮（F）較造模后表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），并與模型組差異具有顯著性（P＜0.05）。其中，麻附辛組、麻附組、麻辛組、地塞米松組血清皮質(zhì)酮（F）高表達(dá)，與其余組差異具有顯著性（P＜0.05）。

2 豚鼠鼻黏膜組織GATA-3mRNA 表達(dá)水平測(cè)定

GATA-3mRNA 表達(dá)情況，麻附辛組與地塞米松組差異無顯著性（P＞0.05），與其他組差異具有顯著性（P＜0.05）。麻附組、麻辛組、模型組三組差異無顯著性（P＞0.05），見表 4、圖 1。

表4 實(shí)驗(yàn)用藥前后豚鼠血清皮質(zhì)醇（F）P 值

表5 各組GATA-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

圖1 GATA-3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

3 豚鼠鼻黏膜組織GATA-3 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的測(cè)定

GATA-3 蛋白在各組豚鼠鼻黏膜中的表達(dá)結(jié)果如下：麻黃附子細(xì)辛組（0.31±0.04），麻黃附子組（0.56±0.06），麻黃細(xì)辛組（0.48±0.05），模型組（0.78±0.06），地塞米松組（0.49±0.04），以上數(shù)據(jù)來自不同實(shí)驗(yàn)次數(shù)（見圖2）。

圖2 GATA-3 在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)

討論

麻黃附子細(xì)辛湯出自《傷寒論》，該方為治療陽虛外感，太陽與少陰二經(jīng)合病的經(jīng)典方劑，其基本病機(jī)是，患者素體少陰真陽不足，腎水失于溫煦，金水無以相生，虛寒內(nèi)伏于肺，又遇太陽外感風(fēng)寒表證，衛(wèi)陽受郁，病邪不得發(fā)散，從太陽直走少陰而合病[11，12]。近幾年，臨床上越來越多的將其應(yīng)用于治療哮喘等變態(tài)反應(yīng)方面的疾病。仝小林院士以“態(tài)靶因果”為指導(dǎo)，應(yīng)用麻黃附子細(xì)辛湯加鵝不食草等治療風(fēng)寒濕型AR 取得較好臨床效果[13]。我們前期臨床中以麻黃附子細(xì)辛湯加味治療肺氣虛寒型變應(yīng)性鼻炎獲得了顯著的療效。通過麻黃附子細(xì)辛湯的藥效有效成分分析，發(fā)現(xiàn)其能改善豚鼠變應(yīng)性鼻炎的癥狀，與小青龍湯相比可明顯降低豚鼠體內(nèi)組胺水平[14]。通過分析麻黃附子細(xì)辛湯的分子成分及治療變應(yīng)性鼻炎的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)麻黃附子細(xì)辛湯能修復(fù)受損鼻黏膜，減少炎癥浸潤(rùn)，其通過作用于多條炎癥、免疫通路[15]，起到抗炎、免疫抑制的作用。

變應(yīng)性鼻炎的免疫機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號(hào)傳導(dǎo)通路。其中以Th1 作用減弱Th2 應(yīng)答增強(qiáng)最為經(jīng)典[16]。

GATA-3 是一種分子量為30000 的蛋白質(zhì)，作為Th2 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子[17]，其主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞，T-bet/GATA-3 表達(dá)失衡是氣道高反應(yīng)性疾病發(fā)病的重要條件。GATA-3 和T-bet 在Th 細(xì)胞的分化調(diào)控中起關(guān)鍵作用，T-bet 主要在Thl 細(xì)胞中表達(dá)，可影響Thl 細(xì)胞的發(fā)育和IFN-γ 的分泌[18]。Th2型細(xì)胞因子IL-4 與其受體結(jié)合后，可激活JAK1/JAK3，其磷酸化又可促使IL-4 受體亞基發(fā)生磷酸化，從而激活STAT-6，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子GATA3。GATA3 的表達(dá)又可促進(jìn)Th0 向Th2 細(xì)胞進(jìn)行分化，產(chǎn)生 IL-4 等 Th2 細(xì)胞因子，形成正反饋調(diào)節(jié)[19，20]。

本課題顯示，麻黃附子細(xì)辛組的GATA-3 蛋白質(zhì)表達(dá)明顯降低，麻黃附子細(xì)辛組及麻附組、麻辛組均能不同程度的調(diào)節(jié)豚鼠AR 的Th1/Th2 上游因子GATA-3 蛋白質(zhì)的表達(dá)，對(duì)Th1/Th2 細(xì)胞失衡有調(diào)節(jié)作用。麻黃附子細(xì)辛湯整方作用更加突出，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與麻附組等另外四組差異具有顯著性（P＜0.05），由此顯示，麻黃附子細(xì)辛湯通過對(duì)GATA-3蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控，特異性的調(diào)控Th2 細(xì)胞的表達(dá)，從而糾正了Th1/Th2 的細(xì)胞失調(diào)，從細(xì)胞因子分子水平驗(yàn)證了麻黃附子細(xì)辛湯組方配伍的合理性。