陳艷春 梅顯偉 徐世影 王干 陳志凌

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis, AR）又稱為過(guò)敏性鼻炎，是由于機(jī)體接觸變應(yīng)原后，導(dǎo)致了IgE 介導(dǎo)的炎性因子釋放，引起鼻黏膜非感染性炎性疾病[1]。其基本病理變化為局部毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加、腺體分泌增加以及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等[2，3]。AR 發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，微小 RNAs（micro-RNAs, miRNAs）參與了許多疾病發(fā)生發(fā)展[4]。先有報(bào)道證實(shí)了miRNAs通過(guò)細(xì)胞因子分泌、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性、平滑肌細(xì)胞增生和表型變化等方式參與了氣道變應(yīng)性疾病[5，6]，提示研究 miRNAs 與 AR 的關(guān)系可能有助于更好地理解AR 發(fā)病機(jī)制。在一項(xiàng)對(duì)AR 患者鼻黏膜上皮基因表達(dá)分析中，發(fā)現(xiàn)許多miRNA的表達(dá)在AR 中被改變，差異表達(dá)的miRNA 似乎參與了AR 的發(fā)展[7]。馮娟等[8]比較了AR 患者與非AR患者鼻腔黏膜組織中的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-223-3p在兩組患者間差異表達(dá)。目前對(duì)AR 患者鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平與疾病患病風(fēng)險(xiǎn)和嚴(yán)重程度關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)AR 患者鼻腔黏膜組織中miR-223 表達(dá)情況，分析miR-223 對(duì)AR 的診斷價(jià)值，miR-223 與AR 患病的嚴(yán)重程度及炎癥因子水平的相關(guān)性，旨在揭示組織miR-223 表達(dá)在AR 疾病發(fā)生發(fā)展中作用。

資料與方法

1 臨床資料

選取2019 年1 月～2020 年12 月我院耳鼻喉科收治的AR 合并鼻中隔偏曲患者35 例作為AR 組，年齡 22～37 歲，平均年齡（28.71±2.92）歲，男 18 例，女17 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合AR 診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；年齡＞18歲；均行手術(shù)治療且手術(shù)前2 周內(nèi)未曾使用過(guò)激素類藥物、抗生素及抗組胺類藥物；可同意配合獲取鼻黏膜組織。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并哮喘發(fā)作；多種因素引起的鼻腔堵塞，包括嚴(yán)重慢性鼻竇炎、鼻息肉及鼻腔鼻竇腫瘤等；患其他嚴(yán)重感染性疾病；合并惡性腫瘤者。同期選擇非AR 的鼻中隔偏曲患者35 例作為對(duì)照組，年齡 22～40 歲，平均（30.06±4.74）歲，男18 例，女17 例。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，參與者均簽署了知情同意書(shū)。兩組患者的一般資料進(jìn)行比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

2 樣本收集

兩組患者均在全麻下，進(jìn)行鼻內(nèi)鏡下鼻中隔偏曲矯正手術(shù)，手術(shù)過(guò)程中切取部分下鼻甲后端黏膜組織（約3mm×3mm），取得組織后立刻用生理鹽水進(jìn)行沖洗處理，將沖洗后的組織放置于盛有RNAlater 液的試管中，-20℃冷凍處理，待檢。

主要試劑

本研究采用的主要試劑包括了總RNA 提取試劑盒、熒光定量PCR 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，miR-223、內(nèi)參基因U6 引物，前三者均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司，后兩者由上海捷瑞生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

表1 引物信息

2.1 鼻黏膜組織miR-223 檢測(cè)

①總RNA 提?。簢?yán)格按照總RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本組織的總RNA，提取RNA 后進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，選擇A260/A280 為1.9～2.0的RNA 樣品，RNA 的完整性用凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。②反轉(zhuǎn)錄cDNA：按照相關(guān)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，進(jìn)行cDNA 的合成。反轉(zhuǎn)錄體系：5μl 的2×miRNA 反應(yīng)混合液、1μl 的 0.1%牛血清白蛋白、1μl的 miRNA PrimeScript RT 酶 混合物、0.5μl 的總RNA、2.5μl 的去 RNA 酶 ddH2O，共 10μl。反應(yīng)條件：37℃ 60min，85℃ 5s，4℃ 30min。③PCR 擴(kuò)增:PCR 反應(yīng)體系：5μl 的 SYBR R remix Ex TaqTMII（2×Conc.）、0.4μl 的上游引物、0.4μl 下游引物、0.2μl 的ROX Reference DyeⅡ（50×Conc.）、1μl 的 cDNA、3μl的 ddH2O，共 10μl。PCR 反應(yīng)條件：50℃ 5min、95℃30s、95℃ 5s、60℃ 34s，反應(yīng)進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣孔設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，取平均 Ct 值進(jìn)行分析。2-ΔΔCt為相對(duì)表達(dá)水平。

2.2 炎癥因子檢測(cè)

術(shù)前采集患者靜脈外周血5ml，2500rab/min 離心10min，離心完成后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測(cè)血清中的 TNF-α、IL-6 和 IL-17 表達(dá)水平。

3 觀察指標(biāo)

①鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平。②變應(yīng)性鼻炎嚴(yán)重程度：采用單個(gè)鼻部癥狀評(píng)分（INSS）和總鼻部癥狀評(píng)分（TNSS）評(píng)估 AR 的嚴(yán)重程度，INSS 為患者自評(píng)，針對(duì)鼻部癥狀進(jìn)行評(píng)分，分別包括流涕、鼻癢、噴嚏及鼻塞共4 種。每種癥狀的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分表示無(wú)癥狀；1 分表示輕度癥狀；2 分表示中度癥狀；3 分表示重度癥狀，評(píng)分越高表明鼻部癥狀情況越嚴(yán)重。上述4 種癥狀的單個(gè)鼻部癥狀評(píng)分之和即為總鼻部癥狀評(píng)分（TNSS）[10]。③兩組患者的TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC 曲線分析miR-223 相對(duì)表達(dá)量對(duì)AR 的診斷價(jià)值。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平對(duì)AR 的診斷價(jià)值

1.1 兩組患者鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平比較

AR 組鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，見(jiàn)表2。

表2 兩組患者鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平比較

1.2 鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量診斷AR 的ROC 曲線分析

根據(jù)ROC 曲線分析結(jié)果顯示，鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量診斷AR 的曲線下面積為0.810，截?cái)嘀禐?.56，靈敏度為83.34%，特異度為78.26%，見(jiàn)圖 1。

圖1 鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量診斷AR 的ROC 曲線

2 AR 患者的INSS 和TNSS 評(píng)分情況及其鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平的聯(lián)系

AR 患者 INSS 評(píng)分中的流涕為（2.32±0.54）分、鼻癢為（2.16±0.63）分、噴嚏為（2.08±0.42）分、鼻塞為（1.87±0.39）分、TNSS 得分為（8.43±2.15）分。其中AR 患者鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量與鼻癢評(píng)分、噴嚏評(píng)分、鼻塞評(píng)分和TNSS 均呈正相關(guān)（P＜0.05），與流涕評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 miR-223 表達(dá)水平與AR 患病嚴(yán)重程度的相關(guān)性

3 鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平與炎癥因子的聯(lián)系

3.1 兩組患者的 TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平比較

結(jié)果顯示，AR 組患者的 TNF-α、IL-6 和 IL-17水平均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表 4。

表4 兩組患者的TNF-α、IL-6 和IL-17 水平比較

3.2 鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平與AR 患者炎癥因子的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，鼻黏膜組織的miR-223表達(dá)水平與AR 患者炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-17 均呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 5。

表5 鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平與AR 患者炎癥因子的相關(guān)性

討論

miRNA 是一類長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 小分子，主要通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄，合成后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)[11]，在諸多疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程扮演著重要作用[12，13]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miR-223 在細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)有很大的變化，在破骨細(xì)胞、巨核細(xì)胞和EOS 分化過(guò)程中表達(dá)增加，在紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)減少[14]。miR-223 在多種炎癥性疾病中被解除管制，例如，其在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血T 淋巴細(xì)胞和滑膜中過(guò)表達(dá)[15，16]，在骨關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞中過(guò)表達(dá)[17]，在炎性腸病（IBD）患者的結(jié)腸黏膜中過(guò)表達(dá)[18]等。因此研究miR-223 與炎癥性疾病的關(guān)系，對(duì)炎癥性疾病的診斷及治療具有重要意義。近年來(lái)miRNA 與AR 的關(guān)系也越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注[19]，但miR-223 在AR 患者中的研究鮮有報(bào)道，因此本文檢測(cè)了AR 患者鼻黏膜組織的miR-223，并研究其與AR 患病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度及炎癥因子水平的聯(lián)系，為AR 的治療提供指導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，AR 組鼻黏膜組織的miR-223 相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且鼻黏膜組織的miR-223 診斷AR 靈敏度為83.34%，特異度為78.26%。提示miR-223 在AR 患者鼻黏膜中過(guò)表達(dá)，其可能參與了AR 的發(fā)生和發(fā)展，且在一定程度上可診斷AR 的發(fā)生。研究中還發(fā)現(xiàn)AR 患者鼻黏膜組織中TNF-α、IL-6 和IL-17 水平高于對(duì)照組患者，分析其原因，AR 患者的鼻黏膜組織中包含大量的肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫效應(yīng)細(xì)胞，可產(chǎn)生并分泌TNF-α、IL-6 和IL-17 等炎癥因子，可參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，當(dāng)機(jī)體在正常狀態(tài)時(shí)，會(huì)嚴(yán)格調(diào)控這類細(xì)胞因子的表達(dá)以及分泌，但是在AR 的病理狀態(tài)下，這類細(xì)胞因子由于出現(xiàn)自身及其相應(yīng)受體缺陷情況，就會(huì)導(dǎo)致其異常表達(dá)的發(fā)生，這類細(xì)胞因子過(guò)高表達(dá)或者過(guò)低表達(dá)均可引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生。而本研究Pearson 相關(guān)分析顯示，miR-223 表達(dá)量與 TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平呈顯著的正相關(guān)，P＜0.05，提示miR-223 的表達(dá)水平與TNF-α、IL-6 和 IL-17 水平密切相關(guān)，認(rèn)為 miR-223的表達(dá)水平越高，TNF-α、IL-6 和 IL-17 的水平就越高，越容易引起變應(yīng)性鼻炎。miR-223 屬于較為常見(jiàn)的一種miRNA，人體多種細(xì)胞和組織中均存在，可參與炎癥反應(yīng)等過(guò)程。AR 患者的miR-223 表達(dá)水平與AR 患病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明miR-223表達(dá)水平與AR 患病的嚴(yán)重程度具有較大的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)[20]，AR 患者的鼻腔黏膜內(nèi)炎癥小體活化情況顯著增強(qiáng)，認(rèn)為miR-223 可能通過(guò)促進(jìn)NLRP3 炎癥小體的活化從而介導(dǎo)炎癥因子的分泌，AR 患者鼻黏膜組織的miR-223 表達(dá)水平越高，炎癥因子的表達(dá)水平就越高，其病情就越嚴(yán)重，也進(jìn)一步提示miR-223 的表達(dá)情況可作為AR 患病嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，miR-223 在AR 患者鼻黏膜組織中異常高表達(dá)，對(duì)AR 具備一定的診斷價(jià)值；鼻黏膜組織中的miR-223 相對(duì)表達(dá)水平與AR 患病嚴(yán)重程度和炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-17 水平均呈正相關(guān)，其有望作為分析AR 發(fā)病機(jī)制及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵指標(biāo)。