楊心怡 孫海勇 冀德君 關(guān)兵

變應性鼻炎（allergic rhinitis, AR）是一種分布廣泛的、且發(fā)病率逐年升高的一種常見的鼻腔變態(tài)反應性疾病，嚴重困擾著人們的學習、工作和生活，其臨床表現(xiàn)主要包括鼻癢、噴嚏、鼻黏膜分泌增加及腫脹等。其病因主要包括環(huán)境因素及遺傳因素兩個方面。AR 是易感個體接觸到相應過敏原后產(chǎn)生的由IgE 介導的由多種炎性介質(zhì)及細胞和細胞因子共同參與的以鼻黏膜慢性炎癥為主要表現(xiàn)的疾病[1]?，F(xiàn)支氣管哮喘發(fā)病機制的研究已頗為深入，人們對支氣管哮喘的認識比變應性鼻炎相對更深刻全面，在已有的對支氣管哮喘發(fā)病機制的研究中，已有充分的證據(jù)表明，與健康人群相比，哮喘病人外周血T細胞類群分布有明顯的差異。其中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號通路參與了T 細胞的增殖與分化。而通過PI3K 通路的分子水平治療哮喘的理念也逐步成型。B 細胞銜接蛋白（B-cell adaptor for phosphatidylinositol 3-kinase，BCAP）是多種免疫系統(tǒng)細胞中炎癥信號傳導的多模塊調(diào)節(jié)劑[2]。BCAP 作為磷脂酰肌醇 3-激酶/ 蛋白激酶 B/雷帕霉素靶蛋白（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B / mammalian target of rapamycin，PI3K /Akt / mTOR）途徑的重要前提，也與哮喘的發(fā)病機制有著密不可分的聯(lián)系。鑒于上、下呼吸道的各組織器官在解剖和功能上的連續(xù)性，1997 年，Grossman 所提出的“同一氣道，同一疾病”的觀念現(xiàn)被大多數(shù)專家學者所認可，因此可以推測BCAP 基因在AR 的發(fā)生發(fā)展過程中也可能有所影響。近年來多名學者的大量研究顯示，PI3K 通過 PI3K/AKT/mTOR 途徑協(xié)調(diào)細胞反應，參與機體多種生命活動，是生長因子受體超家族信號傳導途徑中的一個關(guān)鍵分子，可調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化、存活和遷移等。PI3K 則是通過BCAP（亦稱PI3K AP1）的激活而快速產(chǎn)生。PI3K p85 亞基通過SH3 結(jié)構(gòu)域與BCAP 結(jié)合，形成無活性的復合物，然后通過與SH2結(jié)構(gòu)域的順序結(jié)合而被激活。在呼吸系統(tǒng)疾病中，BCAP 基因與哮喘、慢性鼻-鼻竇炎、肺組織纖維化、慢性阻塞性肺疾病及鼻咽癌等疾病的發(fā)生發(fā)展均有不同程度的相關(guān)性。既有的全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study, GWAS）遺傳研究初步證實了BCAP 基因是AR 的主要遺傳標記[3]。我們在先前RNAseq 分析中發(fā)現(xiàn)，BCAP 基因在變應性鼻炎患者中表達顯著增強，針對差異性表達分析結(jié)果，本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immuno sorbent assay, ELISA）方法進一步檢測了外周血中BCAP 水平，有助于闡明BCAP 基因在AR發(fā)病中的作用機制。

資料與方法

1 一般資料

收集 2016 年 1 月～2017 年 3 月，在江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院行手術(shù)治療的AR 患者21 例為實驗組，診斷標準參照“變應性鼻炎診斷和治療指南”（2015 年天津指南）[4]，其中男性 12 例，女性9 例，年齡（26.14±7.12）歲。另選取健康志愿者6例為對照組，其中男性3 例，女性3 例，年齡（27.16±5.52）歲。術(shù)前均詳細詢問病史（明確有無鼻癢、噴嚏、清涕、鼻塞等AR 癥狀并予以記錄），行硬管鼻內(nèi)鏡檢查，以了解有無鼻腔黏膜蒼白、水腫，鼻腔清水樣分泌物及有無鼻息肉等其他疾病，并行變應原皮膚點刺試驗（skin prick test, SPT）檢測過敏原以確定是否患有AR，并明確排除合并哮喘、特應性皮炎及其他變態(tài)反應性疾病病史者。所有受試者近一月內(nèi)未曾使用過包括抗組胺藥、局部或全身用糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗劑以及其他抗過敏藥物，均未患有高血壓病、糖尿病等其他基礎(chǔ)性疾病，近一月內(nèi)均未患有呼吸系統(tǒng)感染和（或）其他系統(tǒng)感染性疾??；且對照組成員均無變應性鼻炎等變態(tài)反應性疾病家族史及相關(guān)臨床癥狀、體征，且皮膚變應原試驗結(jié)果為陰性。

2 標本收集

所有參與試驗者均于晨起7:00～7:30 間空腹采取左上肢靜脈血約10 ml，予以離心后，取上層血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ渲?，實驗組中21 例（除外AR 癥狀外，不伴有鼻息肉、慢性鼻-鼻竇炎等其它鼻部疾?。┰囼炚哐獦臃謩e標注為A1、A2、A3……A21，及對照組中6 例（健康志愿者）試驗者血樣分別標注為B1、B2……B6。

3 變應原皮膚點刺試驗

實驗試劑：采用阿羅格標準化變應原點刺液。以組胺溶液作為陽性對照，生理鹽水作為陰性對照。

實驗步驟：醫(yī)用酒精消毒患者左前臂掌側(cè)皮膚，待干后于皮膚上做標記，每間隔2 cm 滴1 滴變應原試劑，同時行陰性對照及陽性對照，用點刺針垂直刺入皮膚表皮層，各點刺處均使用新點刺針并均停留1s，靜候15～20min 后觀察檢測結(jié)果。

結(jié)果判斷：如若點刺處出現(xiàn)淡紅色皮丘，周圍伴有斑片狀紅斑，為陽性反應。以皮膚指數(shù)（skin index，SI），即變應原檢測點反應直徑/組胺對照點反應直徑，代表反應強度。當 SI≥2 記為“++++”，1≤SI＜2 記為“+++”，0.5≤SI＜1 記為“++”，SI＜0.5 記為“+”；若與生理鹽水對照點反應相同，則記為“-”。

4 ELISA 驗證及相關(guān)性分析

具體操作步驟為按照試劑說明書將標準品進行稀釋，稀釋成五個梯度，各個梯度每孔加樣量均為50 μl 將酶標板分為空白孔、待測樣品孔。在待測樣品孔中先加入樣品稀釋液至40 μl，再加待測樣品10 μl，輕晃混勻。然后以封板膜封板，并置于37℃環(huán)境下溫育30min。用蒸餾水將30 倍濃縮洗滌液稀釋30 倍后備用；揭開封板膜，棄去液體后甩干，各孔加滿稀釋洗滌液，靜置30s 后棄去，重復上述操作5次，拍干。然后除空白對照空外，每孔各加入酶標試劑50μl，用封板膜封板后再次置于37℃環(huán)境下溫育30min。揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋洗滌液，靜置30s 后棄去，重復5 次后拍干。每孔分別依次加入顯色劑A50μl、顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，在37℃環(huán)境下避光顯色15 min。每孔加終止液 50 μl 終止反應后，15 min 內(nèi)以空白孔調(diào)零，于450 nm 波長依次測量各孔的吸光度（OD 值）。

結(jié)果

依據(jù)ELISA 檢測結(jié)果，以OD 值為橫坐標，以標準品的濃度為縱坐標繪出標準曲線，以標準物濃度與相應OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品所檢測的OD 值代入該直線回歸方程式，計算出樣品濃度，然后乘以稀釋倍數(shù)，即可得出實際的樣品濃度。采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對所得結(jié)果進行統(tǒng)計分析，實驗所得各組濃度值均以均數(shù)±標準差(）的形式表示，而兩組間的相互比較則采用獨立樣本t檢驗的方式進行處理，當P＜0.05 時視為差異具有統(tǒng)計學意義。最終結(jié)果：A 組（實驗組）樣品濃度為 353.410±27.888ng/L，而 B 組（對照組）樣品濃度為 228.006±29.898，所得t值為 9.572，兩組間待測項目BCAP 統(tǒng)計分析得P＜0.001，說明組間統(tǒng)計學具有明顯差異（圖1）；即在實驗組AR 患者血清中的BCAP 含量均明顯高于對照組中健康志愿者。

圖1 兩組間BCAP 差異比較及標準曲線（A：BCAP 濃度差異；B：標準曲線）

討論

BCAP 最初是從雞類DT40 B 細胞中分離出來的p85 SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白[5]。BCAP 基因包含18個選擇性剪接的外顯子，并編碼5 個不同的亞型，包括3 個長型和2 個短型。既往的變應性鼻炎相關(guān)RNA 轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，AR 患者B 細胞受體通路的BCAP 基因顯著高表達，而本次實驗發(fā)現(xiàn)變應性鼻炎患者外周血中的BCAP 含量顯著高于健康對照，與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，BCAP 基因在變應性鼻炎患者中表達增強。因此，我們可得出結(jié)論，即BCAP 基因與AR 的發(fā)生發(fā)展有著一定的關(guān)聯(lián)性。而變應性鼻炎的發(fā)病機制十分復雜，目前研究認為與AR 發(fā)病相關(guān)的信號通路主要包括主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）Ⅱ通路、Toll 樣受體（Toll－like receptors, TLRs）信號通路、T 細胞受體信號通路、B 細胞受體信號通路以及MAPK 信號通路，各通路主要涉及免疫調(diào)節(jié)、信號傳導、炎性反應及細胞因子釋放等諸多方面。BCAP 基因定位于10q24.1，其主要通過B 細胞受體信號通路在自然殺傷細胞的活化過程中發(fā)揮作用[6]，并參與調(diào)控B 細胞的激活、分化及成熟過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR 通路是細胞內(nèi)的經(jīng)典信號通路，對慢性鼻-鼻竇炎等慢性氣道炎性疾病有著重要影響，其主要通過調(diào)控炎癥細胞的活化以及炎性介質(zhì)釋放等方式發(fā)揮作用[7]。PI3K 是位于細胞質(zhì)中的一種脂類激酶，它能夠催化磷脂酰肌醇D3 位磷酸化，在正常細胞中含量很少[8]。AKT 是PI3K 下游反應的關(guān)鍵蛋白[9]。而mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K/AKT 信號通路下游的一個效應蛋白，位于細胞質(zhì)中，主要控制與細胞生長增殖相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，參與調(diào)控炎癥反應及細胞自噬[10]。糖原合成酶激酶 3 （glycogen synthhase kinase3,GSK3）是多種信號通路中的重要調(diào)節(jié)因子，已知有GSK3α 和 GSK3β2 種亞型，其中 GSK3β 是重要的炎性反應調(diào)節(jié)因子，也是PI3K/Akt 信號通路的下游底物之一。IL-6 是常見的可促進炎癥反應的細胞因子，在信號傳導中發(fā)揮著重要作用。已有研究表明，IL-6 可以通過PI3K/Akt 信號通路來選擇性的激活GSK3β，從而增強炎癥反應[11]。

肥大細胞是AR 發(fā)病的主要受體細胞，它通過分泌組胺等多種物質(zhì)，引起AR 早期反應癥狀，并且刺激其他參與晚期反應的粒細胞數(shù)目增加。PI3K 激活明顯抑制了單核細胞，巨噬細胞和樹突狀細胞的炎癥反應，但其通過調(diào)節(jié)組胺、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）、IL-6、鈣離子等在肥大細胞的活化和有肥大細胞介導的分泌中發(fā)揮著重要的作用[12]，增強了肥大細胞和其他潛在粒細胞的免疫反應。此外，PI3K 激活通過其促進B 和T 淋巴細胞的存活和增殖的能力，對于促進免疫反應是必不可少的[13-15]。

而Ponsard C, Seltzer V 等在實驗中發(fā)現(xiàn)且BCAP 在含有纖毛/鞭毛的組織中優(yōu)先表達[16]。BCAP的表達與鼻黏膜上皮細胞黏液纖毛分化過程中纖毛的形成有關(guān)[17]。對此，我們可以進一步對AR 患者鼻黏膜上皮細胞中的BCAP 含量進行檢測，并與患者癥狀評分結(jié)合分析，以驗證AR 患者的鼻分泌物增多是否與BCAP 表達增強相關(guān)。

國內(nèi)的申學良[18]選取寧夏地區(qū)回族、漢族AR患者300 例為實驗組，以同地區(qū)無AR 病史和家族史的健康正常人300 例為對照組，利用聚合酶鏈技術(shù)（polymerase chain reaction, PCR）和基因直接測序法，對BCAP 基因的rs505010 位點進行檢測分析。研究發(fā)現(xiàn)BCAP 基因的rs505010 位點存在基因多態(tài)性變異，但其與寧夏地區(qū)回族、漢族AR 易感性無明顯相關(guān)性。而通過本研究，我們可以初步推斷BCAP 基因與揚州地區(qū)人群的AR 發(fā)病密切相關(guān)，可能是此地區(qū)人群AR 發(fā)病的易感基因之一。此外，在一項以新加坡華人為研究對象的有關(guān)AR 發(fā)病的GWAS 研究中新發(fā)現(xiàn)了BCAP 和MRPL4 兩個候選基因，認為這兩個基因是新加坡華人AR 的易感基因[3]。所以，通過多個實驗研究，我們考慮BCAP 基因在對AR 發(fā)病的影響上具有一定程度的國家、地區(qū)及民族差異性。但總體來說，BCAP 基因可作為AR 治療的一個新思路，甚至作為一個新的可供選擇的藥物靶點。