王轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，陰懷清2，師 睿

缺氧缺血性腦病(HIE)是一種新生兒常見的腦損傷疾病，死亡率高，易長期致殘如智力低下、腦癱、癲癇發(fā)作和學(xué)習(xí)障礙[1]，嚴(yán)重者造成極大的家庭、社會負(fù)擔(dān)，臨床上對該病缺乏有效的治療。依達(dá)拉奉在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是治療腦梗死等缺血性疾病有效的藥物，但依達(dá)拉奉是否可應(yīng)用于治療新生兒HIE尚少見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過建立缺氧缺血性腦損傷模型，觀察依達(dá)拉奉干預(yù)后腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)的變化，探討依達(dá)拉奉腦保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與分組 由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供7日齡SD新生大鼠108只，雌雄不限，平均體質(zhì)量15 g。隨機(jī)分為A組、B組、C組，每組36只。各組再根據(jù)處死時(shí)間6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d分為6個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2 試劑與藥品的配制 一抗(兔抗鼠HIF-1α、Caspase-3)和二抗(即用型SABC試劑盒)及原位末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡試劑盒(購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。規(guī)格5 mL/10 mg的依達(dá)拉奉注射液，用生理鹽水(體積比1∶4)稀釋為0.3 mg/L。

1.3 缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型制備與干預(yù)方法 參照Rice等[2]方法制備HIBD模型。A組為假手術(shù)組，動(dòng)物只切開頸部皮膚并游離出左頸總動(dòng)脈后直接縫合皮膚，不進(jìn)行結(jié)扎和缺氧處理；B組為HIBD模型組；C組在HIBD模型的基礎(chǔ)上給予腹腔注射依達(dá)拉奉4 mg/kg，間隔24 h給藥1次，直至處死。造模后各組動(dòng)物放入飼養(yǎng)籠中母乳喂養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間。

1.4 標(biāo)本留取 各組分別于造模后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 d處死，斷頭取腦，10%甲醛室溫固定24 h后留取視交叉中點(diǎn)前后4～5 mm的腦組織，脫水，石蠟包埋，形成實(shí)驗(yàn)所需組織。

1.5 蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫組織化學(xué)法及TUNEL檢測 石蠟包埋，冠狀位切片，行HE染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)變化；免疫組化法檢測Caspase-3和HIF-1α的表達(dá)；TUNEL法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Caspase-3陽性染色信號定位于細(xì)胞質(zhì)，染色為棕黃色顆粒，HIF-1α陽性染色信號定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色顆粒。

1.6 圖像采集及數(shù)據(jù)收集 應(yīng)用美國Aperio公司Scansaope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描、取圖，統(tǒng)計(jì)出陽性細(xì)胞數(shù)/高倍視野(×400)，取平均值。計(jì)數(shù)大腦皮層凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡率(%)，即凋亡指數(shù)(AI)，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)行為改變情況 A組新生大鼠無異常神經(jīng)行為變化，B組造模后全部發(fā)生不同程度的行為異常改變，主要表現(xiàn)為：躁動(dòng)不安，活動(dòng)增加，頭部和軀體的持續(xù)顫抖；后逐漸由興奮轉(zhuǎn)為抑制，活動(dòng)明顯減少，出現(xiàn)嗜睡，少數(shù)出現(xiàn)驚厥。C組異常表現(xiàn)不如B組明顯。

2.2 腦組織病理變化 A組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦組織解剖層次清晰，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，核深染，核仁清楚，無神經(jīng)細(xì)胞缺失；B組、C組均見大腦組織神經(jīng)細(xì)胞變少、變形，結(jié)構(gòu)混亂，細(xì)胞核縮小、溶解、破碎，符合凋亡的形態(tài)改變；但與C組同一時(shí)刻相比，B組的變化更為明顯。詳見圖1。

圖1 各組大鼠大腦皮層腦組織病理圖(×400)

2.3 大腦皮層HIF-1α的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，腦組織HIF-1α陽性細(xì)胞主要分布于大腦皮層及海馬，胞核或胞漿呈棕黃色。HIF-1α的表達(dá)在A組各時(shí)間點(diǎn)基本維持在一個(gè)水平；在缺氧6 h開始增強(qiáng)，12 h達(dá)高峰，后逐漸下降。C組各時(shí)間點(diǎn)HIF-1α的表達(dá)水平較B組均明顯下降，但高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖2。

表1 各組HIF-1α在不同時(shí)間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)比較(±s) 單位：個(gè)

圖2 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α表達(dá)情況(DAB×400)

2.4 大腦皮層Caspase-3的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，腦組織Caspase-3陽性細(xì)胞主要分布于大腦皮層及海馬，胞漿呈棕黃色。Csapase-3的表達(dá)在A組各時(shí)間點(diǎn)大致維持在一個(gè)水平。C組各時(shí)間點(diǎn)Caspase-3的表達(dá)水平較B組均明顯下降，仍高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2、圖3。

表2 各組Caspase-3在不同時(shí)間點(diǎn)的陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)比較(±s) 單位：個(gè)

圖3 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時(shí)間點(diǎn)Caspase-3表達(dá)情況(×400)

2.5 大腦皮層凋亡細(xì)胞的表達(dá)情況 A組大腦皮層偶見或無凋亡細(xì)胞，B組6 h后可見神經(jīng)細(xì)胞凋亡，之后逐漸增加，5 d達(dá)到峰值，C組各時(shí)間大腦皮層凋亡神經(jīng)細(xì)胞較B組少，但仍高于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3、圖4。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(±s) 單位：%

圖4 各組大鼠腦組織大腦皮層不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(×400)

3 討 論

依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，具有親脂基團(tuán)和高血腦屏障通透性，在保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)變性中起著潛在的作用。它能抑制腦自由基引發(fā)的延遲神經(jīng)元死亡[3]，減輕磷脂膜中多不飽和脂肪酸氧化所致的神經(jīng)元凋亡[4]，并通過減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷從而減輕缺血性腦膜疾病引起的神經(jīng)元損傷[5]。 各種動(dòng)物模型研究表明，依達(dá)拉奉具有神經(jīng)保護(hù)作用[6]，依達(dá)拉奉能保護(hù)神經(jīng)干細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)引起的細(xì)胞凋亡，并能通過抑制腦損傷中的相關(guān)有害分子來治療腦梗死[7]。 Zhang等[8]研究表明，依達(dá)拉奉可以改善急性腦梗死病人的神經(jīng)功能障礙。此外，它對各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病也有影響。

HIF是一種轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)方面似乎很重要。HIF-1活性取決于HIF-1α的表達(dá)水平。在常氧條件下，HIF-1α表達(dá)保持在較低水平，但缺氧顯著誘導(dǎo)其表達(dá)。HIF-1α誘導(dǎo)各種轉(zhuǎn)錄程序，其中包括低氧條件下的多能性因子。 在缺氧缺血期間HIF-1α在神經(jīng)元中的作用存在爭議，認(rèn)為同時(shí)具有促進(jìn)死亡和抗凋亡的雙重作用。 有研究顯示，通過使用來自成年小鼠HIF-1α敲除的腦細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HIF-1α主要促進(jìn)急性低氧環(huán)境中的凋亡；相反，HIF-1α在新生大鼠中度缺氧再灌注腦卒中模型具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]。有研究顯示，HIF-1α通過影響促凋亡因子表達(dá)，參與新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的進(jìn)程，抑制自身表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦損傷[10]。在HIE的發(fā)病過程中，凋亡是遲發(fā)性神經(jīng)損傷的主要死亡形式。細(xì)胞凋亡是一系列導(dǎo)致Caspase激活和細(xì)胞解體的程序性事件，其中Caspase-3在細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中處于核心位置[11]。有研究表明，腦缺血時(shí)HIF-1α不僅能通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax 來抑制Caspase-3，還能通過血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)機(jī)制、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通路及ERK信號通路來調(diào)控Caspase-3的活性，從而抑制Caspase級聯(lián)放大反應(yīng)，最終減少神經(jīng)細(xì)胞損傷[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對照組Caspase-3與HIF-1α不表達(dá)或者僅有少量表達(dá)，HIBD后Caspase-3與HIF-1α明顯增加，推斷Caspase-3與HIF-1α參與了缺氧缺血腦損傷的發(fā)生；建立新生大鼠HIBD模型并給予依達(dá)拉奉干預(yù)，顯示依達(dá)拉奉治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織Caspase-3與HIF-1α表達(dá)水平較HIBD組均明顯降低，且凋亡細(xì)胞明顯減少，此外，治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織病理變化較HIBD組輕，說明依達(dá)拉奉在一定程度上通過抑制腦組織中Caspase-3與HIF-1α的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。