何欒櫻 林子淳 盧建東 熊國良* 王詩卉

(1.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100029； 2.深圳市中醫(yī)院， 深圳 518000)

引 言

雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook F)系衛(wèi)矛科植物，主要產(chǎn)自浙江、江蘇等地。雷公藤作為一種傳統(tǒng)中藥材，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，其性涼味辛，歸肝、腎經(jīng)，具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[2]，是臨床上首選的中藥免疫抑制劑。然而雷公藤的治療劑量接近中毒劑量[1]，極大地限制了在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，雷公藤的減毒持效研究成為近年關(guān)注的焦點(diǎn)。雷公藤的主要化學(xué)成分為生物堿類、萜類，其中，生物堿類主要成分有雷公藤春堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤定堿；二萜類主要成分有雷公藤甲素、雷酚內(nèi)酯；三萜類主要成分有雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲。它們既是雷公藤的主要藥效成分，同時(shí)也是減毒持效的主要監(jiān)測(cè)對(duì)象。

雙向固體發(fā)酵技術(shù)(bidirectional solid fermentation)是以藥用真菌發(fā)酵藥性基質(zhì)的一種技術(shù)[3]，產(chǎn)物藥性菌質(zhì)常表現(xiàn)出高于真菌和藥性基質(zhì)相加的藥效[2-4]，該技術(shù)具有增效、解毒、擴(kuò)大藥用范圍等顯著優(yōu)勢(shì)。靈芝(GanodermalucidumKarst)是多孔菌科真菌，同時(shí)也是藥理活性優(yōu)良的藥材。在雙向固體發(fā)酵中，靈芝作為發(fā)酵菌種已經(jīng)得到許多應(yīng)用，例如可以明顯增強(qiáng)草烏的抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]，有助于附片的解毒增效[6]，對(duì)于中藥的毒性和藥效有很好的改善作用。作為發(fā)酵中藥的常用菌種，靈芝也是發(fā)酵雷公藤的良好選擇，其產(chǎn)物命名為靈雷菌質(zhì)。莊毅等[7]建立了靈芝雙向固體發(fā)酵雷公藤的工藝，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵30天得到的靈雷菌質(zhì)相比于雷公藤生藥表現(xiàn)出了減毒持效的作用。侯志帆等[8]檢測(cè)了雷公藤發(fā)酵前后的成分變化，結(jié)果表明雙向固體發(fā)酵可以降低雷公藤中有毒化合物的含量。以上研究僅檢測(cè)了小鼠給藥后的死亡情況和淋巴細(xì)胞的增殖情況，并且僅進(jìn)行了液相色譜檢測(cè)，辨認(rèn)出雷公藤甲素和鄰苯二甲酸酯類成分含量的下降。而靈雷菌質(zhì)對(duì)于炎癥因子釋放的影響還未見報(bào)道，對(duì)于人正常肝細(xì)胞的體外毒性還未經(jīng)檢驗(yàn)，并且雷公藤的主要成分在雙向固體發(fā)酵中的變化也沒有監(jiān)測(cè)。

研究表明，雷公藤的抗炎作用與機(jī)體細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)有關(guān)，現(xiàn)有成藥雷公藤多苷(tripterygium glycosides)主要通過影響toll樣受體4/核因子- κB(TLR4/NF- κB)信號(hào)通路，拮抗和抑制炎癥因子的釋放，包括人腫瘤壞死因子TNF- α[9]、人白細(xì)胞介素IL- 1β和IL- 6[10-11]等，從而發(fā)揮抗炎作用[12-13]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以識(shí)別并激活TLR4，常用于啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。巨噬細(xì)胞通常處于基態(tài)，活化后可向促炎的M1和免疫抑制的M2兩種表型進(jìn)行轉(zhuǎn)化[14]。巨噬細(xì)胞受LPS刺激后，活化成M1表型，分泌TNF- α、IL- 6等M1型標(biāo)志物以及一氧化氮合酶iNOS等炎癥因子，可以用作藥物抗炎的研究模型[15]。

體外研究表明，雷公藤甲素可以通過啟動(dòng)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激而導(dǎo)致肝損傷。在人正常肝細(xì)胞L02中，雷公藤甲素(處理濃度60～180 nmol/L，處理時(shí)間12～48 h)表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴的細(xì)胞毒性[16]，通過引發(fā)人正常肝細(xì)胞L02活性氧水平升高[17]、線粒體膜電位去極化，從而誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示，肝臟是雷公藤毒性損傷的易感靶器官之一[18]。雷公藤肝毒性與功效密切相關(guān)，高劑量的雷公藤可使肝臟形成實(shí)質(zhì)性損傷甚至壞死[19]。

本文以靈芝為藥用真菌，采用雙向固體發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵藥性基質(zhì)雷公藤，得到發(fā)酵30天和40天的產(chǎn)物靈雷菌質(zhì)，比較它們對(duì)LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子以及對(duì)人正常肝細(xì)胞增殖的影響，并使用液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用(LC- MS)方法分析了雷公藤在發(fā)酵前后的成分變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

雷公藤購自上海源葉生物科技有限公司，靈芝菌種購自中國微生物菌種保藏管理中心，小鼠RAW264.7細(xì)胞系購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞系購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，TNF- α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒和IL- 6 ELISA試劑盒購自默沙克生物技術(shù)有限公司，LPS和CCK- 8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，高糖DMEM培養(yǎng)基和RPMI- 1640培養(yǎng)基購自北京沃卡威生物技術(shù)有限公司，雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純，購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器

超凈工作臺(tái)(SW- CJ- 1D型，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(311型，Thermo Fisher公司)，恒溫恒濕培養(yǎng)箱(LHC- 150型，北京陸?？萍加邢薰?，高壓滅菌鍋(BKQ- B50Ⅱ型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)，電子天平(BSA224S型，Sartorius公司)，酶標(biāo)儀(K3Plus型，上海寶予德科學(xué)儀器有限公司)，離心機(jī)(Heraeus Pico 17型，Thermo Fisher公司)，恒溫干燥箱(DGG- 9070A型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，超高效液相色譜四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(XEVO- G2QTOF#YCA121型，Waters公司)。

1.2 雙向固體發(fā)酵

在無菌條件下從靈芝母種斜面上切取0.5 cm3菌塊，轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面培養(yǎng)基上，置于28 ℃、相對(duì)濕度60%的條件下培養(yǎng)6天進(jìn)行活化[20-21]。在無菌條件下從活化的靈芝斜面上切取3～4塊1 cm3菌塊，接入裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于28 ℃且避光的條件下以120 r/min培養(yǎng)6天，挑選液體澄清、菌球大小均勻的液體種子作為發(fā)酵菌種。液體種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO40.75 g/L，CaCO32.5 g/L，VB10.1 g/L。

將雷公藤于55 ℃干燥粉碎，過五號(hào)篩(篩孔尺寸為0.177 mm)后用量筒量取粉末，以100 mL/瓶的量加入到250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min后均勻接種靈芝菌種，接種量分別為7 mL/100 mL(命名為N1組)和10 mL/100 mL(命名為N2組)，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照。置于27 ℃[22]、相對(duì)濕度60%且避光的條件下培養(yǎng)，定期補(bǔ)充一定水分，每天觀察靈芝的生長情況并拍照記錄全瓶期、旺盛度等。在發(fā)酵的第30天和第40天，從N1組和N2組中收集靈雷菌質(zhì)，于55 ℃干燥粉碎，所得靈雷菌質(zhì)粉末分別標(biāo)記為N1- G30(N1組發(fā)酵30天)、N2- G30(N2組發(fā)酵30天)、N1- G40(N1組發(fā)酵40天)、N2- G40(N2組發(fā)酵40天)。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中僅含雷公藤中藥基質(zhì)。

精密稱取靈雷菌質(zhì)及雷公藤粉末0.2 g，置于2 mL無菌管中進(jìn)行提取，加入無水甲醇1.5 mL，于30 ℃、500 W超聲提取1 h，冷卻至室溫，以12 000 r/min離心10 min，分離得到上清液。隨機(jī)取樣10組，每組樣本重復(fù)提取3次?；旌厦拷M上清液，經(jīng)過0.22 μm微孔濾膜后，將一部分濾液直接用于成分檢測(cè)，另一部分繼續(xù)凍干，然后精密稱取0.1 mg重新溶解于1 mL超純水中，于121 ℃滅菌20 min，然后稀釋成不同濃度用于細(xì)胞試藥。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠RAW264.7細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，傳代周期為2～3天，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

人正常肝細(xì)胞L02置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以含有10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，傳代周期為2～3天，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 ELISA試驗(yàn)

通過ELISA試驗(yàn)檢測(cè)靈雷菌質(zhì)對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放TNF- α和IL- 6的影響。小鼠RAW264.7細(xì)胞以每孔10 000個(gè)/100 μL接種于96孔板，LPS處理的質(zhì)量濃度為1 μg/mL，雷公藤、靈雷菌質(zhì)處理的質(zhì)量濃度為3.75 μg/mL。設(shè)置對(duì)照組(加入LPS但未加樣品(雷公藤、靈雷菌質(zhì)))，試驗(yàn)組(加入LPS和樣品)。將各組置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，離心后仔細(xì)收集上清，使用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF- α和IL- 6的相對(duì)含量。

1.5 CCK- 8試驗(yàn)

通過CCK- 8試驗(yàn)檢測(cè)靈雷菌質(zhì)對(duì)人正常肝細(xì)胞L02增殖的影響。人正常肝細(xì)胞L02以每孔10 000個(gè)/100 μL接種于96孔板，雷公藤和靈雷菌質(zhì)處理的質(zhì)量濃度為1.88、3.75、7.5 μg/mL。設(shè)置對(duì)照組(有細(xì)胞但未加樣品(雷公藤、靈雷菌質(zhì)))，試驗(yàn)組(有細(xì)胞且加入樣品)。使用CCK- 8試劑盒測(cè)定細(xì)胞吸光度值，按照式(1)計(jì)算細(xì)胞活力。

(1)

式中，C為細(xì)胞活力，Ac為試驗(yàn)組吸光度值，Ab為對(duì)照組吸光度值，A0為背景吸光度值。

1.6 LC- MS測(cè)試

通過LC- MS對(duì)比雷公藤和靈雷菌質(zhì)的成分差異[23-24]。將樣品適當(dāng)稀釋后進(jìn)行檢測(cè)。色譜運(yùn)行條件：以水- 乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.2 mL/min，柱溫45 ℃，進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜運(yùn)行條件：ESI+，掃描質(zhì)量范圍為質(zhì)荷比m/z50～1 500，毛細(xì)管電壓3 000 V，檢測(cè)器電壓3 000 V，步長5 spectra/s。運(yùn)用MassLynx V4.1軟件處理分析數(shù)據(jù)，采用Elemental composition計(jì)算m/z對(duì)應(yīng)的分子式，推測(cè)相關(guān)成分。結(jié)果具有高分辨率，對(duì)于m/z956，分辨率≥20 000半高全寬(FWHM)，且不損失靈敏度；對(duì)于m/z152.071 2，分辨率≥10 000 FWHM，且不損失靈敏度。分析時(shí)調(diào)用4位的m/z。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin統(tǒng)計(jì)軟件(2018版)進(jìn)行分析，樣本均數(shù)的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重復(fù)數(shù)n=3，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 雷公藤雙向型固體發(fā)酵過程觀察

雷公藤接種靈芝進(jìn)行雙向固體發(fā)酵，在發(fā)酵過程中密切觀察N1組和N2組錐形瓶中靈芝的生長狀況，并拍照記錄，結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵第8天，N2組開始出現(xiàn)靈芝菌絲；發(fā)酵第14天，N1組開始出現(xiàn)靈芝菌絲；發(fā)酵第17天，N2組中靈芝已基本長滿全瓶；發(fā)酵第22天，N1組中靈芝已長至半瓶，N2組已完全長滿全瓶；發(fā)酵第25天，N1組中靈芝已基本長滿全瓶；發(fā)酵第30天，N1組中靈芝已完全長滿全瓶，N2組中部分靈芝成柱狀生長；發(fā)酵第40天，N1組中出現(xiàn)柱狀靈芝，N2組中柱狀靈芝生長迅速。結(jié)果表明，在7 mL/100 mL和10 mL/100 mL的接種量下，30天可以使靈芝對(duì)雷公藤進(jìn)行充分發(fā)酵，并且接種量較多的靈芝生長更快。

圖1 N1組和N2組中靈芝的生長狀況Fig.1 Growth status of Ganoderma lucidum in N1 and N2 groups

2.2 靈雷菌質(zhì)的抗炎評(píng)價(jià)

圖2為不同樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF- α的影響。由圖2(a)可知，N1- G30和N2- G30組的TNF- α相對(duì)含量均低于雷公藤組。N1- G30組的TNF- α相對(duì)含量為0.236，與雷公藤組相比降低了22.37%(P<0.01)；N2- G30組的TNF- α相對(duì)含量為0.274，與雷公藤組相比降低了9.87%(P<0.05)。由圖2(b)可知，N1- G40和N2- G40組的TNF- α相對(duì)含量與雷公藤組沒有顯著差異(P>0.05)。

*P<0.05，**P<0.01，n.s.表示P>0.05，下同。圖2 不同樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF- α的影響Fig.2 Effects of different samples on the content of TNF- α released from RAW264.7 cells induced by LPS

圖3為不同樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放IL- 6的影響。由圖3(a)可知，僅N2- G30組的IL- 6相對(duì)含量低于雷公藤組，N2- G30組的IL- 6相對(duì)含量為0.220，與雷公藤組相比降低了19.12%(P<0.05)。由圖3(b)可知，N1- G40和N2- G40組的IL- 6相對(duì)含量均低于雷公藤組。N1- G40組的IL- 6相對(duì)含量為0.567，與雷公藤組相比降低了15.5%(P<0.05)；N2- G40組的IL- 6相對(duì)含量為0.451，與雷公藤相比降低了32.79%(P<0.01)。

圖3 不同樣品對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放IL- 6的影響Fig.3 Effects of different samples on the content of IL- 6 released from RAW264.7 cells induced by LPS

綜合以上結(jié)果可知，在3.75 μg/mL的質(zhì)量濃度下，對(duì)于LPS誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放TNF- α的抑制作用，N1- G30、N2- G30組強(qiáng)于雷公藤組；對(duì)于LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞釋放IL- 6的抑制作用，N2- G30、N1- G40、N2- G40組強(qiáng)于雷公藤組。雖然各雷公藤組與對(duì)照組相比沒有抑制炎癥因子的釋放，但是文獻(xiàn)中已有雷公藤在體外抑制炎癥因子的報(bào)道[25]，可能是因?yàn)榇继崛〉臈l件、試驗(yàn)的質(zhì)量濃度無法表現(xiàn)出雷公藤的抗炎活性。靈雷菌質(zhì)的醇提取物中，只有N2- G30對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞釋放TNF- α和IL- 6同時(shí)有抑制作用，表現(xiàn)出的抗炎活性有較好的提升。因此，本文進(jìn)一步探索N2- G30的醇提取物對(duì)人正常肝細(xì)胞L02增殖的影響。

2.3 靈雷菌質(zhì)的肝毒性評(píng)價(jià)

圖4為不同質(zhì)量濃度下雷公藤和N2- G30對(duì)人正常肝細(xì)胞L02增殖的影響。由結(jié)果可知，在1.88 μg/mL的質(zhì)量濃度下，N2- G30組的細(xì)胞活力為51.6%，與雷公藤組相比提高了8.48%(P<0.05)。在3.75 μg/mL的質(zhì)量濃度下，N2- G30組的細(xì)胞活力為43.76%，與雷公藤組相比提高了14.04%(P<0.05)。在7.5 μg/mL的質(zhì)量濃度下，N2- G30組的細(xì)胞活力與雷公藤組沒有顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，與其他質(zhì)量濃度相比，3.75 μg/mL的N2- G30表現(xiàn)出更好的減毒效果。

圖4 不同質(zhì)量濃度下不同樣品對(duì)L02細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of different samples at different mass concentrations on the cell viability of L02 cells

2.4 雷公藤發(fā)酵前后的成分變化

為了進(jìn)一步探究雷公藤和N2- G30醇提取物的成分差異，選取雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照進(jìn)行LC- MS測(cè)試，結(jié)果如圖5所示。發(fā)酵前后的樣品在不同保留時(shí)間tR處的色譜峰出現(xiàn)了強(qiáng)度不一致的情況，表明靈芝雙向固體發(fā)酵使雷公藤的成分產(chǎn)生了明顯的變化。

圖5 雷公藤發(fā)酵前后的基峰離子色譜圖Fig.5 Ion chromatograms of basic peaks before and after fermentation of Tripterygium wilfordii

2.4.1雷公藤甲素

圖6為雷公藤甲素的質(zhì)譜峰，未提取到色譜峰進(jìn)行面積積分。雷公藤發(fā)酵前后都檢測(cè)到雷公藤甲素的存在，標(biāo)準(zhǔn)品、雷公藤發(fā)酵前、發(fā)酵后雷公藤甲素的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z361.165 5[M+H]+、m/z361.164 6[M+H]+、m/z361.164 7[M+H]+。雷公藤發(fā)酵后的峰強(qiáng)度由發(fā)酵前的18 950增加到40 804，表明雷公藤甲素的含量增加，這與雷公藤抗炎活性的維持有關(guān)。

每個(gè)峰的第一行數(shù)字表示峰強(qiáng)度，第二行數(shù)字表示質(zhì)荷比，下同。圖6 雷公藤甲素的質(zhì)譜峰Fig.6 Mass spectra peaks of triptolide

2.4.2雷公藤紅素

圖7和圖8分別為雷公藤紅素的質(zhì)譜峰和色譜峰。雷公藤發(fā)酵前后都檢測(cè)到雷公藤紅素的存在，標(biāo)準(zhǔn)品、雷公藤發(fā)酵前、發(fā)酵后雷公藤紅素的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z451.284 7[M+H]+、m/z451.283 8[M+H]+、m/z451.284 9[M+H]+。發(fā)酵后雷公藤紅素的質(zhì)譜峰強(qiáng)度由發(fā)酵前的120 793增加到622 700，色譜峰面積積分由發(fā)酵前的121增加到1 023，均表明雷公藤紅素的含量增加，這與雷公藤抗炎活性的維持有關(guān)。

圖7 雷公藤紅素的質(zhì)譜峰Fig.7 Mass spectra peaks of celastrol

每個(gè)峰的第一行數(shù)字表示保留時(shí)間，第二行數(shù)字表示面積積分。圖8 雷公藤紅素的色譜圖Fig.8 Chromatograms of celastrol

2.4.3雷酚內(nèi)酯

圖9為雷酚內(nèi)酯的質(zhì)譜峰，未提取到色譜峰進(jìn)行面積積分。雷公藤發(fā)酵前后都檢測(cè)到雷酚內(nèi)酯的存在，標(biāo)準(zhǔn)品、雷公藤發(fā)酵前、發(fā)酵后雷酚內(nèi)酯的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z313.180 3[M+H]+、m/z313.180 3[M+H]+、m/z313.179 8[M+H]+。發(fā)酵后的峰強(qiáng)度由發(fā)酵前的21 816增加到158 216，表明雷酚內(nèi)酯的含量增加，這與雷公藤抗炎活性的維持有關(guān)。

圖9 雷酚內(nèi)酯的質(zhì)譜峰Fig.9 Mass spectra peaks of triptophenolide

2.4.4其他成分

通過m/z查找雷公藤春堿、雷公藤晉堿、雷公藤次堿、雷公藤定堿、雷公藤內(nèi)酯甲的疑似峰，計(jì)算并推測(cè)其分子式，結(jié)果只得到雷公藤內(nèi)酯甲，其[M+H]+對(duì)應(yīng)的分子式為C30H47O3。圖10為雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)譜峰，未提取到色譜峰進(jìn)行面積積分。發(fā)酵前、發(fā)酵后雷公藤內(nèi)酯甲的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z455.351 0[M+H]+、m/z455.350 0[M+H]+，并且都存在丟失中性H2O分子的特征峰m/z437.340 3[M+H-H2O]+，進(jìn)一步丟失—CH3碎片形成m/z422.327 9[M+H-H2O-CH3]+及m/z422.348 7[M+H-H2O-CH3]+。發(fā)酵后的準(zhǔn)分子離子峰的峰強(qiáng)度由發(fā)酵前的184 028降低至123 972，表明雷公藤內(nèi)酯甲的含量減少[26]，這與雷公藤的減毒作用直接相關(guān)。

圖10 雷公藤內(nèi)酯甲的質(zhì)譜峰Fig.10 Mass spectra peaks of wilforlide A

3 結(jié)論

N2- G30的質(zhì)量濃度為3.75 μg/mL時(shí)，對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞在脂多糖誘導(dǎo)下釋放兩種促炎因子TNF- α和IL- 6都有抑制作用，并且對(duì)人正常肝細(xì)胞L02的增殖毒性較小。N2- G30中，雷公藤甲素、雷公藤紅素、雷酚內(nèi)酯含量的增加與雷公藤抗炎活性的維持有關(guān)，而雷公藤內(nèi)酯甲含量的減少與雷公藤的減毒作用直接相關(guān)。說明靈芝雙向固體發(fā)酵(接種量10 mL/100 mL，發(fā)酵時(shí)間30天)能夠通過成分的變化影響雷公藤的活性與毒性，從而促進(jìn)其減毒持效作用的產(chǎn)生。靈芝雙向固體發(fā)酵技術(shù)在中藥減毒持效上的應(yīng)用是值得重視的，今后應(yīng)在協(xié)調(diào)好雷公藤“量- 效- 毒”關(guān)系的基礎(chǔ)上，不斷改進(jìn)雙向發(fā)酵技術(shù)，從而在根本上降低雷公藤的毒性，真正實(shí)現(xiàn)安全有效地用藥。