王淳濱，楚 俏，劉 康，郝夢(mèng)林，張茹夢(mèng)，馬 靜，王佳佳

(1.河南大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，抗體藥物開(kāi)發(fā)技術(shù)國(guó)家與地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 河南，開(kāi)封，475001；2.河南大學(xué) 臨床學(xué)院 河南，開(kāi)封，475001；3.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南，開(kāi)封，475001)

0 引言

在真核生物中，翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)通常需要被進(jìn)一步加工修飾，以滿足其結(jié)構(gòu)、活性、功能的需求。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括糖基化、乙酰化、磷酸化、甲基化等[1-5]。其中蛋白質(zhì)的糖基化修飾在維持細(xì)胞正常生理功能以及參與病理變化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6]。蛋白質(zhì)的糖基化修飾是將低聚糖與蛋白質(zhì)上特殊的氨基酸以共價(jià)結(jié)合的方式組合到一起，包括N-連接的糖蛋白，O-連接的糖蛋白等。其中O連接的N-乙酰葡糖胺(O -linked β-N-acetyl glucosamine,O-GlcNAc)糖基化是一類(lèi)特殊的O-糖基化修飾[7-10]，主要發(fā)生在蘇氨酸和絲氨酸殘基。O-GlcNAc糖基化在腫瘤[11,12]、糖尿病[13,14]等慢性疾病發(fā)生時(shí)，常常伴隨著O-GlcNAc糖基化異常激活或沉默，故探究不同疾病中O-GlcNAc糖基化水平的變化對(duì)進(jìn)一步明確發(fā)病機(jī)制具有重要意義。此外，O-GlcNAc糖基化與磷酸化修飾相似，可在環(huán)境因素的刺激下通過(guò)酶的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行糖基化與去糖基化，從而調(diào)控復(fù)雜的生命活動(dòng)[15-17]，但與磷酸化修飾不同的是，參與調(diào)節(jié)糖基化與去糖基化的酶只有O-GlcNAc 轉(zhuǎn)移酶(O-GlcNAc transferase,OGT)和O-GlcNAc 水解酶(O-GlcNAcase,OGA)[18]。氨基己糖生物合成途徑可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡萄胺(UDP-N -acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)，從而被OGT識(shí)別并與目的蛋白連接，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)疊氮或者炔基官能團(tuán)修飾的非天然糖可以經(jīng)由相應(yīng)的補(bǔ)救途徑轉(zhuǎn)變?yōu)閁DP形式的糖，進(jìn)而被OGT識(shí)別并利用[19-24]，隨后利用疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)可以對(duì)O-GlcNAc糖基化的蛋白定位或者對(duì)靶蛋白富集，為O-GlcNAc糖基化異常相關(guān)疾病的研究提供新的途徑。目前已報(bào)道多種疊氮或者炔基修飾的非天然小分子探針用于研究O-GlcNAc糖基化蛋白種類(lèi)和位點(diǎn)鑒定(圖1)[19,21,24]。其中2-脫氧-N-疊氮乙酰氨基全乙?；咸烟茿c4GlcNAz和相應(yīng)的半乳糖構(gòu)型Ac4GalNAz是兩種經(jīng)典探針，其合成方法一般是以氨基葡萄糖或者氨基半乳糖為起始原料，在甲醇、金屬鈉條件下與氯乙酸酐反應(yīng)生成2-脫氧-N-氯乙?；〈穆闾侵虚g體，通過(guò)疊氮化和全乙酰化得到目標(biāo)產(chǎn)物。雖然該方法步驟簡(jiǎn)短，但是反應(yīng)中所需的金屬鈉存在一定的安全隱患[19]。此外，某些課題組將葡萄糖氨基鹽酸鹽與疊氮乙酸直接耦連，再進(jìn)行全乙?；?，該方法中所需的疊氮乙酸價(jià)格較高[25]。因此，開(kāi)發(fā)安全、高效、經(jīng)濟(jì)的方法用于合成該類(lèi)探針，對(duì)推動(dòng)O-GlcNAc相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究具有重要的意義。

圖1 已報(bào)道的O-GlcNAc糖基化小分子探針

本文以氨基葡萄糖鹽酸鹽為起始原料，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到小分子探針6，總收率44%，經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6具有高效的糖基化標(biāo)記效率，為后續(xù)O-GlcNAc糖基化等相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。此外，在步驟3中化合物4在丙酮、濃鹽酸、50 ℃的條件下得到中間體7，該中間體在365 nm下具有很強(qiáng)的吸收，本文通過(guò)核磁質(zhì)譜等方法進(jìn)一步確定其結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明中間體7是一種與查耳酮以及姜黃素結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，在抗癌和抗氧化活性方面具有重要的生物學(xué)意義[26-28]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

葡萄糖氨基鹽酸鹽購(gòu)買(mǎi)自北京凱森萊科技有限公司；茴香醛，氯乙酰氯購(gòu)買(mǎi)于百靈威試劑有限公司；核磁檢測(cè)采用Bruker 300 M和400 M核磁共振，LC-MS分析儀器采用Waters 3100。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物3的合成。將化合物1(10 g，46 mmol)溶解在10.2 mL的5 mol/L 氫氧化鈉溶液中，在冰浴條件下攪拌，隨后加入茴香醛(5.64 mL，46 mmol，1 eq)，待反應(yīng)凝成固體在4 ℃保存過(guò)夜。次日將混合物用水，乙醇，石油醚：乙酸乙酯10：1沖洗抽濾，干燥，得到化合物12.6 g2，產(chǎn)率88%，不需純化，直接用于下一步合成；取部分化合物2(3.97 g，13.8 mmol)溶解在20 mL 的吡啶溶液中，在冰浴條件下攪拌，隨后逐滴加入乙酸酐(7.84 mL，83 mmol，6 eq)，在冰浴條件下逐漸恢復(fù)室溫，攪拌過(guò)夜。次日用二氯甲烷與稀鹽酸萃取，干燥，得到化合物3(5.8 g)，產(chǎn)率91%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.21 (s，1H),7.67 (d,J=8.4 Hz,1H),6.92 (d,J=8.4 Hz,1H),5.94 (d,J=8.0 Hz,1H),5.46 (d,J=3.2 Hz,1H),5.26 (dd,J=10.4,3.0 Hz,1H),4.27-4.07 (m,3H),3.84 (s,3H),3.68-3.53 (m,1H),2.17 (s,3H),2.06 (s,3H),2.03 (s,3H),1.89 (s,3H);13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 170.40,170.09,169.63,168.69,164.47,162.32,130.27,114.07,93.52,71.78,71.56,68.76,65.98,61.33,55.42,20.77,20.68,20.51.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C22H27NO10:465.1635,found:465.1637.

1.2.2 化合物4和7的合成。將化合物3(5 g，10.7 mmol)溶解在適量的丙酮中，放上冷凝管，升高溫度至50 ℃，攪拌10 min，迅速加入2.5 mL濃鹽酸，立即生成大量固體，待其冷卻至室溫，加入適量的乙醚，出現(xiàn)顆粒狀懸浮，用紙蓋住燒杯口，放入冰水等待2-3 h。加入石油醚：乙酸乙酯10：1沖洗抽濾，干燥，得到化合物4(3.5 g)，產(chǎn)率85%，直接用于下一步的合成；中間體7的核磁數(shù)據(jù)：1H NMR (300 MHz,CDCl3) δ 7.72 (d,J=15.6 Hz,2H),7.62 (d,J=8.7 Hz,4H),7.03-6.96 (m,6H),3.89 (s,6H)；13C NMR (75 MHz,CDCl3) δ 188.90,161.59,142.71,130.11,127.68,123.54,114.45,55.44.

1.2.3 化合物5的合成。將化合物4(3 g，7.8 mmol)在真空條件下溶解在20 mL二氯甲烷中，插上氣球，隨后加入5 mL吡啶，將反應(yīng)處于冰浴條件下，持續(xù)攪拌，隨后逐滴加入氯乙酰氯(1.22 mL，15 mmol，2 eq)，過(guò)夜，加入適量的甲醇淬滅反應(yīng)，攪拌10 min，濃縮后用稀鹽酸與二氯甲烷萃取，干燥，得到化合物5(3.3 g)，產(chǎn)率89%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 6.42 (d,J=8.8 Hz,1H),6.19 (d,J=3.6 Hz,1H),5.31-5.17 (m,2H),4.46-4.40 (m,1H),4.25 (dd,J=12.4,4.0 Hz,1H),4.07-3.90 (m,2H),3.92 (s,2H),2.19 (s,3H),2.07 (s,3H),2.04 (s,3H),2.03 (s,3H);13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 170.47,170.16,169.37,166.73,92.46,71.85,69.85,66.37,61.28,50.36,42.44,20.89,20.69,20.62.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C16H22ClNO10:423.0932,found:423.0935.

1.2.4 化合物6的合成。將化合物5(1.8 g，4.2 mmol)與NaN3(0.54 g，8 mmol，2 eq)混合，加入10 mL DMF溶解，攪拌，升溫至70 ℃，反應(yīng)過(guò)夜。次日，旋蒸將DMF旋出，經(jīng)硅膠層析柱分離純化(石油醚：乙酸乙酯=3：1)，得到1.3 g目標(biāo)化合物6，產(chǎn)率72%。1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ 6.42 (d,J=8.8 Hz),6.19 (d,J=3.6 Hz),5.31-5.17 (m,2H),4.46-4.40 (m,1H),4.25 (dd,J=12.4,4.0 Hz,1H),4.07-3.90 (m,2H),3.92 (s,2H),2.19 (s,3H),2.07 (s,3H),2.04 (s,3H),2.03 (s,3H).13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ 171.51,170.64,169.13,168.65,166.87,90.26,70.34,69.81,67.43,61.49,52.43,51.24,20.66.HRMS (ESI):m/z [M+NH4]+calculated for C16H22N4O10:448.1680,found:448.1677.

1.2.5 細(xì)胞的培養(yǎng)和代謝標(biāo)記。將HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃和5.0%二氧化碳的培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%-85%密度，向細(xì)胞中加入終體積為200 μmol/L Ac4GlcNAz或相應(yīng)體積的DMSO作為對(duì)照，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.6 Western blot檢測(cè)探針6標(biāo)記效率。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，500 r/min離心5 min，去除培養(yǎng)基后，用無(wú)菌PBS清洗兩遍；在每個(gè)小皿中加入200 μL細(xì)胞裂解液(1×lysis buffer、PMSF、25倍蛋白酶抑制劑、10倍磷酸酶抑制劑)，于4 ℃層析柜中，裂解30 min；裂解結(jié)束后，12000 r/min、4 ℃離心10 min；離心結(jié)束后，將含有蛋白的上清液取出到新的EP管中并進(jìn)行BCA蛋白定量；取200 μg體積蛋白，另取一支1.5 mL離心管依次加入170 μL裂解液，0.2 μL 100 mmol/L CuSO4(終濃度100 μmol/L),0.4 μL 100 mmol/L THPTA (CuSO4:THPTA=1:2,摩爾數(shù)比)，0.2 μL 100 mmol/L Biotin-PEG-Alkyne(終濃度100 μmol/L)，室溫反應(yīng)2 h，在蛋白樣品中加入1 mL冰甲醇，于-80 ℃靜止2 h，取出后于10000 g，4 ℃離心10 min；加入500 μL冰甲醇，吹洗蛋白，再次離心，棄掉上清液，蛋白于室溫晾干15 min；每管加入80 μL 4% SDS buffer(4% SDS,150 mmol/L，50 mmol/L TEA pH7.4)，另加20 μL 5×loading buffer，煮沸10 min；配膠，每孔上樣30 μL蛋白，進(jìn)行電泳分析；電泳結(jié)束后，以280 mA、180 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(NC膜，GE公司)；將轉(zhuǎn)好的膜在TBST配置的5%脫脂牛奶中在室溫下進(jìn)行封閉；孵育HRP-Streptavidin(1:10000稀釋)，1 h后，PBST清洗3×10 min；)對(duì)清洗過(guò)后的膜加入化學(xué)發(fā)光液爆片分析。

2 結(jié)果與討論

本課題以商品化的葡糖糖氨基鹽酸鹽為起始原料，在5 M氫氧化鈉作用下與對(duì)甲氧基苯甲醛作用生成亞胺結(jié)構(gòu)，對(duì)葡萄糖的二位氨基進(jìn)行臨時(shí)保護(hù)；隨后在吡啶和醋酸酐的作用下進(jìn)行全乙?；Ｗo(hù)得到中間體3；接著在滴加少量濃鹽酸的熱丙酮溶液中脫除二位保護(hù)基，靜置冷卻至室溫，加入乙醚混勻并抽濾，得到關(guān)鍵中間體4；最后在吡啶溶液中與氯乙酰氯反應(yīng)在二位引入氯乙?；?，并發(fā)生疊氮化，最終順利得到目標(biāo)產(chǎn)物2-疊氮乙酰氨基-1,3,4,6-四乙?；咸烟?(圖2)，并通過(guò)核磁、驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)確實(shí)為理想產(chǎn)物。我們將200 μmol/L探針6與Hek293T細(xì)胞孵育24 h，設(shè)置空白對(duì)照組，收集細(xì)胞并裂解提取蛋白，通過(guò)與Biotin-PEG4-Alkyne發(fā)生click反應(yīng)，最終經(jīng)由western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)我們合成的探針6與對(duì)照組相比具有很高的標(biāo)記效率(圖3)，與之前報(bào)道的文獻(xiàn)一致[19]。

圖2 糖代謝分子探針6的合成路線

圖3 化合物6在293T細(xì)胞進(jìn)行糖基化標(biāo)記的機(jī)制和結(jié)果

此外，在合成目標(biāo)化合物6的過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)步驟3即濃鹽酸和50 ℃丙酮的條件下，生成了一種在365 nm紫外燈照射下具有強(qiáng)烈吸收，且極性偏小的副產(chǎn)物，具備一般熒光探針的特性。為探究其具體結(jié)構(gòu)，首先我們將反應(yīng)液混合物進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，結(jié)果如圖4所示，液相中保留時(shí)間為2.64與9.42 min位置呈現(xiàn)兩組峰(圖4(a))，根據(jù)化合物的極性分析，保留時(shí)間9.42 min為我們重點(diǎn)研究的熒光化合物，其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)的分子離子峰的分子量為295.5 m/z(圖4(b)),與理論計(jì)算值295.3相符；為進(jìn)一步確定中間產(chǎn)物7的結(jié)構(gòu)，我們將其經(jīng)柱層析純化，通過(guò)核磁氫譜和質(zhì)譜確定其結(jié)構(gòu)如圖2所示，為一種具有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的α，β不飽和酮，是一種與查耳酮以及姜黃素結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物。

圖4 通過(guò)LC-MS分析化合物7的結(jié)構(gòu)

根據(jù)中間體7的結(jié)構(gòu)，本文推測(cè)了其生成的可能機(jī)理(圖5)。首先，在酸性條件下丙酮的羰基氧被質(zhì)子化，通過(guò)異構(gòu)共振形成具有親核性能的碳負(fù)離子中間體d；其次，從糖環(huán)上脫下來(lái)的保護(hù)基對(duì)甲氧基苯甲醛在酸性條件下被質(zhì)子化，與d發(fā)生親核加成生成β-羥基酮f，中間體f在加熱條件下失去一分子水，生成α，β-不飽和醛h；隨后，h再次或者同時(shí)發(fā)生類(lèi)似的過(guò)程即可得到中間體7。

圖5 中間體7生成的可能機(jī)理

為進(jìn)一步分析中間體7的熒光性能，我們首先對(duì)中間體7進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長(zhǎng)為362 nm(圖6(a))，與姜黃素的吸收波長(zhǎng)為425 nm相比較短，其原因是7結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的甲氧基的供電效應(yīng)不如羥基高，致使吸收波長(zhǎng)的差異。隨后，我們配制了化合物7的系列濃度梯度，并在362 nm下檢測(cè)吸收與濃度的依賴(lài)性(圖6(b))，結(jié)果表明，在固定波長(zhǎng)下，中間體7展現(xiàn)了良好的濃度依賴(lài)性。

圖6 中間體7的全波長(zhǎng)掃描及濃度與波長(zhǎng)的關(guān)系

3 結(jié)論

本文以氨基葡萄糖鹽酸鹽為原料，通過(guò)5步反應(yīng)得到目標(biāo)產(chǎn)物6，通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)表明化合物6可以高效標(biāo)記O-GlcNAc糖基化蛋白。因化合物6結(jié)構(gòu)中含有疊氮官能團(tuán)，可利用疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行熒光標(biāo)記和目標(biāo)蛋白富集，對(duì)O-GlcNAc糖基化蛋白質(zhì)的標(biāo)記及其相關(guān)研究有重要的細(xì)胞生物學(xué)意義。此外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了一種有趣的中間體7，并通過(guò)NMR和HRMS等確定其結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明中間體7是一種與姜黃素結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物，具有較強(qiáng)的熒光性能。因此，我們推測(cè)中間體7將來(lái)可用于開(kāi)發(fā)一種高效、低毒的新型光敏劑，其次可能在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、活血止痛具有重要的生物學(xué)意義[25-27]。