石凱威, 鄭尊濤, 趙婷婷, 朱宇珂, 馬 成, 李 莉*,

(1. 中國科學(xué)院 動物研究所 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

乳酸菌是可以發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的一類細(xì)菌的統(tǒng)稱，在自然界和食品中廣泛存在[1]，已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、蔬菜制品和軟飲料等食品加工業(yè)中[2]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的乳酸菌有43個屬，包括373個種和亞種，按照形態(tài)可分為乳酸桿菌族和鏈球菌族[3-4]。

研究證明，乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物對部分有機(jī)磷農(nóng)藥有較強(qiáng)的降解作用。王晶等[5-6]發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌Lactobacillus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum和副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei3株乳酸菌對脫脂乳培養(yǎng)基上的7種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留有一定的降解作用；薄力影等[7]研究表明，選擇的7種有機(jī)磷農(nóng)藥42 ℃條件下在牛奶樣品中的半衰期為11.0～16.7 h，而在兩個乳酸菌發(fā)酵的酸奶樣品中半衰期分別減少至9.6～14.6 h和10.0～15.9 h。目前，有關(guān)乳酸菌對手性農(nóng)藥的選擇性降解報道較少，陸躍樂[8]研究發(fā)現(xiàn)，在有乳酸菌參與的醬油和泡菜加工過程中，S-禾草靈的降解快于其對映體，說明發(fā)酵過程中產(chǎn)生了選擇性降解。

馬拉硫磷是一種常用的有機(jī)磷農(nóng)藥，有1個手性中心，2個對映異構(gòu)體 (圖式1)。對馬拉硫磷對映異構(gòu)體的拆分研究已經(jīng)較為成熟，王鵬等[9-10]考察了流動相中改性劑種類、改性劑含量以及溫度對拆分效果的影響。結(jié)果表明，異丙醇、丁醇和異丁醇都適合作為改性劑，較低的醇含量和低溫都有利于分離效果的提高。馬拉硫磷異構(gòu)體殺蟲活性和選擇性降解行為研究表明，R-對映體的殺蟲活性高于S-對映體，且將馬拉硫磷乳油在大白菜、葡萄、甜菜、水稻以及小麥上噴施后表現(xiàn)出不同的選擇性行為[11]；馬拉硫磷在黃土和紅土中的降解半衰期分別為3.5 h和4.3 h，左旋對映體降解較快[12]。馬拉硫磷對映體的神經(jīng)毒性差異研究結(jié)果表明，R-對映體對神經(jīng)細(xì)胞生長的抑制效應(yīng)高于其外消旋體和S-對映體[13-14]；可見，對于馬拉硫磷的風(fēng)險評估僅依靠外消旋體的數(shù)據(jù)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

本研究采用培養(yǎng)基模擬方法，針對保加利亞桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌4種酸奶發(fā)酵中常用的乳酸菌種，對馬拉硫磷的手性選擇性降解進(jìn)行了研究，能為推測酸奶釀制和儲存過程中手性農(nóng)藥對映體選擇性降解，開展手性農(nóng)藥在乳產(chǎn)品等食品中的風(fēng)險評估，以及對人體的健康安全性評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及藥劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA USA)，配有紫外檢測器；Agilent 35900E型數(shù)模轉(zhuǎn)換器和IBZ旋光檢測器(IBZ Messtechnik GMBH公司)。

馬拉硫磷 (malathion) 標(biāo)準(zhǔn)品 (純度99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，異丙醇和正己烷均為色譜純(Mallinckrodt Baker)。濃鹽酸、氫氧化鈉、乙腈、丙酮、石油醚和氯化鈉均為分析純 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。弗羅里硅土固相萃取凈化柱和氨基固相萃取凈化柱 (1 g/6 mL，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。淋洗液為V(丙酮) :V(石油醚) = 1 : 9。

保加利亞桿菌Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus、嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus、植物乳桿菌Lactobacillus plantarumsubsp.plantarum和干酪乳桿菌Lactobacillus casei凍干菌粉 (中國普通微生物菌種保藏管理中心)。MRS培養(yǎng)基成分(分析純)：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三銨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水1 000 mL。MRS培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后待用。

1.2 立體選擇性降解試驗(yàn)

1.2.1 含馬拉硫磷的 MRS 液體培養(yǎng)基的制備 在超凈工作臺中，將50 mg/kg馬拉硫磷外消旋體標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，搖勻。取10 mL分裝至50 mL離心管中。

1.2.2 菌株傳代培養(yǎng) 在超凈工作臺中，將在 ?80 ℃冰箱中保存的乳酸菌甘油母液取出，在室溫條件下自然解凍，用移液槍 (配有滅菌后的槍頭) 以體積分?jǐn)?shù)0.5%的接菌量接種在滅菌后的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中恒溫培養(yǎng)，48 h后以0.5%的接菌量轉(zhuǎn)接于新的MRS液體培養(yǎng)基中。為確保菌株的穩(wěn)定，傳代選在穩(wěn)定期，以48 h為一個傳代周期。為保證乳酸菌的活性，使用第4代菌進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.3 接種和取樣 在超凈工作臺中，用移液槍(配有滅菌后的槍頭) 將活化后的第4代菌接種于含馬拉硫磷的MRS液體培養(yǎng)基中，接菌量分別為體積分?jǐn)?shù)0 (對照)、0.5%和5.0%。接種后置于37 ℃搖床中恒溫培養(yǎng)，分別于0、2、4、8、20、32、48、96、168和288 h取樣測定馬拉硫磷對映體的含量，同時測定菌液的OD600值和pH值。每個處理重復(fù)3次。

乳酸菌的生長情況通過OD600值進(jìn)行監(jiān)測：取200 μL菌液至比色皿中，用蒸餾水稀釋至2 mL，用紫外分光光度計(jì)測定OD600值。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 在10 mL MRS培養(yǎng)基中準(zhǔn)確加入20 mL乙腈，振蕩1 min，加入6 g氯化鈉，混勻1 min，于3 000 r/min下離心5 min；取10 mL上清液至茄型瓶中，于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干；用5 mL淋洗液預(yù)淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液；用5 mL淋洗液洗滌茄型瓶中殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至固相萃取柱中，再用10 mL淋洗液分兩次洗脫；收集全部洗脫液，于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用正己烷定容至2.5 mL，過0.22 μm有機(jī)濾膜，待測。

1.3.2 色譜檢測條件 Agilent 1200 高效液相色譜儀；CHIRALCEL OD-H (4.6 mm × 250 mm,5 μm) 手性柱；進(jìn)樣量20 μL；流動相為V(正己烷) :V(異丙醇) = 98 : 2；流速1 mL/min；柱溫箱溫度為室溫；檢測波長230 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 分離度 按公式 (1) 計(jì)算分離度 (R)。

式中，t1和t2分別代表峰1和峰2的保留時間；W1和W2分別代表峰1 和峰2在峰底的峰寬。當(dāng)R≤1時表示兩峰有部分重疊；當(dāng)1

1.4.2 一級動力學(xué)方程 按公式 (2) 和 (3) 采用指數(shù)回歸方程求降解半衰期（t1/2）。

式中，ct代表t時間的農(nóng)藥殘留量；c0代表初始濃度；k代表降解速率常數(shù) 。

1.4.3 馬拉硫磷對映體選擇性降解測定 采用對映體分?jǐn)?shù) (EF值) 作為馬拉硫磷對映體選擇變化的指標(biāo)，按公式 (4) 計(jì)算。

式中，A1代表先流出的對映體殘留量；A2代表后流出的對映體殘留量。EF值的范圍在0～1之間，當(dāng)EF = 0.5時表示兩個對映體降解速率相同，沒有對映體選擇性。當(dāng)EF<0.5和EF>0.5時均表明馬拉硫磷產(chǎn)生了立體選擇性降解，偏離的值越大，選擇性越明顯[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 對映體拆分方法的確定

試驗(yàn)測試了使用手性色譜柱CHIRALCEL OD-H在不同流動相 (V(正己烷) :V(異丙醇)=90 :10、94 : 6和98 : 2) 以及不同定容溶劑 (異丙醇或正己烷) 下馬拉硫磷兩個對映異構(gòu)體的拆分情況。結(jié)果 (表1) 顯示，在3種流動相比例條件下，只有當(dāng)V(正己烷) :V(異丙醇) = 98 : 2時實(shí)現(xiàn)了兩峰的基線分離，且正己烷定容的分離度大于異丙醇，因此，最終選擇V(正己烷) :V(異丙醇) =98 : 2作為流動相，定容溶劑選擇正己烷。

表1 馬拉硫磷在不同條件下的拆分Table 1 The chromatographic separation of malathion under different conditions

2.2 對映體旋光性分析

在1.3.2節(jié)檢測條件下，先流出對映體的旋光度為右旋 (+)，后流出對映體的旋光度為左旋 (?)，其紫外和旋光圖如圖1所示。本研究拆分條件與Sun[11]的基本一致，可以確定先流出的異構(gòu)體構(gòu)型為R-(+)-馬拉硫磷，后流出的為S-(?)-馬拉硫磷。

2.3 分析方法確證

按1.3節(jié)的方法進(jìn)行1、50和150 mg/kg 3個水平的添加回收試驗(yàn)。結(jié)果顯示：馬拉硫磷R-對映體的平均回收率在84%～90%之間，RSD在1.5%～19%之間；S-對映體的平均回收率在81%～90%之間，RSD在2.0%～11%之間。在0.5～500 mg/L范圍內(nèi)，馬拉硫磷的峰面積與其質(zhì)量濃度間呈良好線性關(guān)系，R-對映體的線性方程為y= 3.860 6x+2.490 5，R2= 0.999 9；S-對映體的線性方程為y=3.865 1x+ 1.769 0，R2= 1.000 0。所建方法可以準(zhǔn)確對MRS培養(yǎng)基中的馬拉硫磷進(jìn)行定量。

2.4 乳酸菌增殖情況及pH值變化

結(jié)果 (圖2) 表明，4種乳酸菌在0～24 h內(nèi)的生長速度最快，于36 h時達(dá)到最大值，之后逐漸保持穩(wěn)定；穩(wěn)定后，干酪乳桿菌0.5%接菌量的處理，其菌液濃度略高于5.0%接菌量的處理，其他3種乳酸菌5.0%接菌量的處理，其菌液濃度略高于0.5%接菌量接菌量的處理。表明乳酸菌的對數(shù)生長階段是在前48 h。此后，乳酸菌菌量保持穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定生長階段。

本研究同時對培養(yǎng)基pH值進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，4種乳酸菌在0～24 h內(nèi)pH值從7降到5，之后維持在5不變；對照組 (接菌量0%) 的pH值穩(wěn)定在7。

2.5 馬拉硫磷對映異構(gòu)體的選擇性降解

馬拉硫磷對映異構(gòu)體的降解符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程。由 (表2) 數(shù)據(jù)可以看出：隨培養(yǎng)時間延長兩個對映異構(gòu)體呈穩(wěn)定降解趨勢。對照組中，R-馬拉硫磷的半衰期在4.0～6.0 d之間，S-馬拉硫磷的半衰期在3.9～5.6 d之間；處理組中，R-馬拉硫磷的半衰期在5.4～6.5 d之間，S-馬拉硫磷的半衰期在5.1～6.3 d之間。處理組和對照組間半衰期無明顯差異，表明乳酸菌對馬拉硫磷降解沒有明顯影響。

表2 馬拉硫磷對映體的降解方程、相關(guān)系數(shù)和半衰期 (n = 3)Table 2 The degradation equation, correlation coefficient (r), and halflives of malathion enantiomers in culture medium (n = 3)

4種乳酸菌不同接菌量的EF值變化曲線如圖3所示。在開始取點(diǎn)時 (0 h) 對照組和乳酸菌處理組的EF值均接近0.50。經(jīng)過12 d培養(yǎng)后，兩個對映異構(gòu)體的EF值均保持在0.50左右，R-對映體和S-對映體半衰期的比值在0.98～1.07之間。處理組中乳酸菌種類、接菌量等因素對兩個對映體的降解無明顯影響，表明4種乳酸菌對馬拉硫磷沒有立體選擇性降解作用。與前人研究結(jié)果[6]相比，本文側(cè)重點(diǎn)在于對農(nóng)藥異構(gòu)體選擇性降解的分析，且對不同乳酸菌菌株和接菌量的影響分別進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

建立并優(yōu)化了MRS培養(yǎng)基中馬拉硫磷兩個對映異構(gòu)體提取和高效液相色譜分析方法，經(jīng)方法的有效性檢驗(yàn)證明，本方法準(zhǔn)確度、精密度和線性范圍均滿足檢測要求。通過向MRS培養(yǎng)基中添加馬拉硫磷外消旋體的方式，將植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌4種乳酸菌以不同接菌量接種，通過不同培養(yǎng)時間采樣測定乳酸菌的活性和pH值變化情況，以及對馬拉硫磷對映體降解的影響。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，4種乳酸菌均不會加速馬拉硫磷的降解，并且不同菌種、接菌量和乳酸菌活性等因素均不會對馬拉硫磷產(chǎn)生立體選擇性降解。馬拉硫磷兩個對映體在乳酸菌處理組和對照組中的降解速率相近，不產(chǎn)生立體選擇性降解。該研究結(jié)果為乳酸菌發(fā)酵制品中手性農(nóng)藥殘留膳食攝入風(fēng)險評估的完善提供了數(shù)據(jù)支持，可為未來開展相關(guān)領(lǐng)域的研究提供方法學(xué)借鑒和參考。