鄧燕紅，游顏杰，郭建陽，唐媛媛，陳 雯，高瑞萍

結(jié)直腸癌(CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，是胃腸道腫瘤的第二位[1]。好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。早期結(jié)直腸癌因臨床癥狀不明顯，早期發(fā)現(xiàn)較為困難，有很多患者在終末期才被確診。而臨床上因手術(shù)操作的局限性、放化療的毒副作用及耐藥性一直是制約該疾病診治的主要原因。因此，確定一個有效的結(jié)直腸癌藥物靶點至關(guān)重要。食管癌相關(guān)基因4(ECRG4)，又稱C2orf40或Augurin，其基因定位于人染色體2q12.2(Genbank accession No.AF325503)，編碼全長由148個氨基酸殘基組成的分泌型蛋白質(zhì)[2]，是從人正常食管組織中鑒定和克隆的一個抑癌基因。目前一些研究表明,ECRG4作為一種潛在的抑癌基因可以抑制食管癌、食管鱗癌、頭頸部鱗狀細胞癌、人腦膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、膀胱癌及乳腺癌的腫瘤發(fā)展[1,3-7]。另一項研究表明,ECRG4下調(diào)能抑制結(jié)腸癌細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡[8]。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測ECRG4在結(jié)腸癌臨床標(biāo)本中的表達狀態(tài)，旨在探討其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性及患者的生存期關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本：購買上海芯超公司結(jié)腸癌組織石蠟包埋標(biāo)本組織芯片，包括2007年1月-2010年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的98例結(jié)腸癌組織，樣本來源于上海市腫瘤疾病研究所。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer)pTNM分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期17例，Ⅲ期20例，Ⅵ期28例；病理組織學(xué)分型：Ⅰ期35例，Ⅱ期44例，Ⅲ期19例?；颊咝g(shù)前未接受任何放化療和生物治療。對所有患者資料進行電話生存隨訪截至2018年5月，其中死亡49例。

1.2 主要試劑：兔抗人ECRG4多克隆抗體購自英國Abcam公司，EnVision兩步法試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司，DAB 試劑購自中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色：手術(shù)切除標(biāo)本固定在10%福爾馬林緩沖液中，石蠟包埋，二甲苯逐級脫蠟3次，每次10 min;梯度酒精回水，室溫下用0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性30 min。為了提取抗原，組織切片在121 ℃檸檬酸鹽緩沖液(10 mM/L，pH 6.0)中高壓滅菌10 min。用ECRG4抗體(工作濃度為1∶100)孵育，以EnVision二部法進行染色。ECRG4抗體工作濃度為1∶100，DAB顯色，蘇木素核染色，鹽酸分化，脫水透明后封片。以PBS代替ECRG4抗體作為實驗空白對照。

1.4 結(jié)果判定：標(biāo)本由病理科醫(yī)師采用單盲法按照文獻判定標(biāo)準(zhǔn)閱片，即陽性表達定位于胞漿，出現(xiàn)明顯的黃色至棕黃色顆粒。免疫組化染色通過結(jié)合癌區(qū)的強度(0，無染色；1，弱染色；2，中度染色；3，強染色)和分布(0，陰性；1，1%～25%的腫瘤細胞染色；2，26%～50%的腫瘤細胞染色；3，51%～75%的腫瘤細胞陽性；4，76%～100%以上的腫瘤細胞)進行評估。如果以染色強度與染色陽性細胞百分率的乘積為總評分進行分組，≤ 6分為抗體低表達組，> 6分為抗體高表達組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，生存期比較采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中ECRG4表達與臨床病理特征的關(guān)系：結(jié)腸癌組織中ECRG4蛋白主要表達于結(jié)腸癌細胞的細胞漿中(圖1，目錄后)。97例臨床樣本中，有49例為ECRG4呈高表達(50.5%)，48例為ECRG4呈低表達(49.5%)。ECRG4蛋白的表達與病理組織學(xué)分級比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但ECRG4蛋白表達水平在結(jié)腸癌的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移以及TNM分期上其構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 結(jié)腸癌組織中ECRG4表達狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.2 ECRG4和結(jié)腸癌預(yù)后參數(shù)的關(guān)系：Kaplan-Meier分析顯示,高ECRG4高表達組的總體生存期[(67.980±4.358)個月；95%CI=59.438～76.522)]顯著高于ECRG4低表達組[(40.306±4.432)個月；95%CI=31.619～48.993)]，見圖2(封三)。

2.3 ECRG4和結(jié)腸癌預(yù)后的多因素生存時間分析：高ECRG4表達組是低ECRG4表達組的0.262倍，是提高生存時間的主要因素(HR=0.262，95%CI0.141～0.486；P<0.05)。此外，病理分級是結(jié)腸癌患者總生存率的重要預(yù)后指標(biāo)(HR=4.058，95%CI2.381～0.486；P<0.05)。多變量Cox回歸分析顯示，ECRG4高表達、病理分級和TNM分期對結(jié)腸癌患者的總生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但高ECRG4表達是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立保護因素(HR=0.381，95%CI0.202～0.72；P<0.05)，見表2,圖3(封三)。

表2 結(jié)腸癌患者總生存率的單變量和多變量分析

3 討論

目前，已有研究顯示ECRG4在一些癌組織中是沉默的或明顯的下調(diào)[3-6]，包括結(jié)腸癌，這些研究結(jié)果提示ECRG4可能作為一種抑癌基因，負調(diào)控癌細胞的增殖、侵襲、抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。ECRG4由LI等人首次報道發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀上皮細胞癌中ECRG4表達顯著增高[3]，這一研究結(jié)果提示ECRG4是一種抑癌基因?；蚪MDNA 甲基化水平和模式的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一[9]。本課題組前期研究了ECRG4在鼻咽癌中的抑癌基因功能，發(fā)現(xiàn)基因啟動子高頻甲基化是造成ECRG4表達下調(diào)的重要原因[4]。TANG等人研究發(fā)現(xiàn)ECRG4在人乳腺癌細胞和細胞系中沉默，可能是由于啟動子甲基化，ECRG4可能作為腫瘤抑制因子，抑制了細胞增殖和遷移[10]。本課題組另一研究顯示，ECRG4蛋白表達缺失與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良總生存期有顯著相關(guān)性[5]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ECRG4蛋白的表達在病理組織分級為Ⅰ/Ⅱ與Ⅲ有顯著相關(guān)性。Cox單因素分析結(jié)果顯示病理分級為Ⅲ級較Ⅰ/Ⅱ級是結(jié)腸癌患者總生存率的不利因素，也就是說結(jié)腸癌惡性程度越高的患者其生存率越低。另外，腫瘤組織TNM分期對結(jié)腸癌患者的生存率也存在著影響。本研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期較Ⅰ～Ⅱ是影響結(jié)腸癌患者總生存率的不利因素。鄧鵬的研究結(jié)果也顯示，胃癌組織中ECRG4下調(diào)與胃癌分化程度TNM分期密切相關(guān)[11]。結(jié)合患者預(yù)后資料進一步分析顯示，ECRG4高表達結(jié)腸癌患者組的總體生存期顯著高于ECRG4低表達患者組。進一步通過Cox生存回歸分析顯示，結(jié)腸癌患者總生存率單因素分析顯示ECRG4高表達是減少相對危險度、提高生存時間的主要因素，多因素分析結(jié)果也顯示ECRG4高表達是結(jié)腸癌預(yù)后的獨立保護因素。本研究結(jié)果提示ECRG4可能是結(jié)腸癌的一種抑癌基因，可作為預(yù)測結(jié)腸癌患者生存的一個生物標(biāo)志物。

盡管ECRG4在結(jié)腸癌組織中是低表達狀態(tài)，具有潛在的抑癌活性，但這些抗腫瘤活性仍然是不清楚的。目前的研究結(jié)果顯示，ECRG4基因編碼的一種細胞因子/趨化因子樣分泌蛋白，與上皮癌的發(fā)展和進展、細胞周期的進展和凋亡、細胞的衰老和遷移以及炎癥、損傷和感染反應(yīng)性有關(guān)[2]。在我們之前的研究者中發(fā)現(xiàn)，在食管癌、鼻咽癌中ECRG4表達的下調(diào)或缺失與啟動子甲基化過度有關(guān)[4,5]。同樣，在其他研究中也顯示在結(jié)直腸癌、前列腺癌、胃癌中也發(fā)現(xiàn)了ECRG4啟動子甲基化[12]。通過檢測外周血ECRG4甲基化可能對這些腫瘤的診斷篩查、檢測腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)揮著重要作用。為更準(zhǔn)確了解ECRG4在結(jié)腸癌發(fā)病機制中的作用，在未來還需要更深入的研究去探索。