伍巍蘭 吳華君 吳 莎 陳 君 李健豪

惡性腫瘤目前已嚴(yán)重危害人類的健康，腫瘤血管新生理論指出腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移取決于新生血管形成，其所需的ATP 85%來自糖酵解。磷酸果糖激酶-2/果糖-2，6-二磷酸酶（PFKFB3）作為糖酵解途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶，其小分子抑制劑3PO可以顯著降低糖酵解速率，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少血管萌芽及新生［1-3］，抑制腫瘤新生血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而抗腫瘤藥物缺乏靶向性且存在一定程度的毒副作用，降低了藥物的療效，限制了其臨床應(yīng)用。超聲脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物作為一種良好的藥物載體，具有載藥量高和聲學(xué)性能良好的優(yōu)點(diǎn)，可以將藥物靶向輸送到局部組織，并結(jié)合超聲破壞技術(shù)局部釋放藥物，進(jìn)而提高藥物的靶向性和治療效果，減少全身毒副作用［4］。本實(shí)驗(yàn)擬通過生物素-親和素系統(tǒng)將載3PO脂質(zhì)體連接到普通微泡表面，獲得載3PO脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物（3PO-LMC），觀察其一般特征，探討其體外超聲顯影及控制釋放能力，旨在為聯(lián)合超聲輔助給藥體系在腫瘤治療領(lǐng)域提供一種新的、有效的藥物載體。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

二硬脂酸磷脂酰膽堿（DSPC）、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、生物素化脂質(zhì)（DSPE-PEG 2000-Biotin）、聚乙二醇（PEG）-40硬脂酸酯、膽固醇（美國Avanti公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）、鏈親和素、Triton X-100（美國Sigma公司）；3PO（美國Selleck公司）；氯仿（CHCl3）、甲醇、丙二醇、甘油（上海化學(xué)試劑廠）；乙腈、磷酸鹽（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；細(xì)胞膜紅色熒光探針（DiI，中杉金橋）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末（廣州尚鴻生物科技有限公司）；全氟丙烷（C3F8，廣東華特氣體股份有限公司）；生理鹽水（廣東大冢制藥有限公司）；三氟乙酸（TFA，上海吉至生化科技有限公司）。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

倒置熒光顯微鏡（BX51，日本Olympus公司）；透射電子顯微鏡（HT770，日本Hitachi公司）；低溫高速離心機(jī)（Avanti JXN-30，美國Beckman Coulter公司）；激光粒度儀（Mastersizer 3000，英國馬爾文儀器有限公司）；庫爾特分析儀（MultisizerⅢ，美國Beckman Coulter公司）；高效液相色譜儀（SHIMADZU/LC-16，日本島津公司）；水浴超聲清洗儀（PS-80，深圳潔康超聲波科技有限公司）；銀汞調(diào)和器（YJT，上海醫(yī)療器械股份有限公司）；彩色多普勒超聲診斷儀及超聲成像系統(tǒng)（Acuson Sequoia 512，德國西門子公司）；反相色譜柱（Zorbax RP-C18，美國Agilent公司）。

三、主要實(shí)驗(yàn)方法

（一）3PO-LMC的制備

1.生物素化載3PO脂質(zhì)體（3PO-LPs）的制備及其特征檢測(cè)：將DPPC、膽固醇和DSPE-PEG 2000-Biotin按摩爾比60∶40∶5溶解于CHCl3中，然后加入5 mg 3PO，通過氮?dú)獯蹈尚纬闪字?，?5℃真空干燥箱內(nèi)去除殘余CHCl3，將PBS（pH值7.4）加入試管中，置于62℃水浴超聲清洗儀中直至脂質(zhì)體澄清，磷脂最終濃度為10 mg/ml。采用激光粒度儀測(cè)定脂質(zhì)體的粒徑及Zeta電位；高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率。

2.生物素化普通微泡（MBs）的制備及其特征檢測(cè)：應(yīng)用機(jī)械振蕩法制備核心氣體為C3F8的脂質(zhì)微泡。將DPPC、PEG-40硬脂酸酯和DSPE-PEG 2000-Biotin按摩爾比82∶10∶8溶解于裝有丙二醇的三角錐形瓶中，另加入適量的生理鹽水和甘油（體積比95∶5），分別置于70℃水浴鍋中至溶液變澄清透明時(shí)混合，以恒量持續(xù)通入氮?dú)庵粱旌弦涸俅巫兦宄?，即可制得磷脂分散液。然后分裝于西林瓶中加蓋密封，C3F8氣體置換，使用銀汞調(diào)和器機(jī)械振蕩45 s后制得微泡懸浮液。采用庫爾特分析儀測(cè)定微泡的粒徑及濃度。

3.3PO-LMC的制備：通過生物素-親和素連接方式偶聯(lián)MBs和3PO-LPs，向MBs中加入0.5 mg/ml親和素蛋白孵育15 min后，使用PBS離心洗滌3次去除未結(jié)合的親和素蛋白，再加入200μl 3PO-LPs孵育30 min，PBS離心洗滌3次后獲得3PO-LMC。

（二）一般特征檢測(cè)

1.形態(tài)學(xué)觀察：取100μl微泡濃度為1×108/ml的MBs和100μl 3PO-LPs各用PBS稀釋至1 ml，分別與FITC、DiI孵育30 min，PBS洗滌、純化后獲得FITC標(biāo)記的MBs和DiI標(biāo)記的3PO-LPs，然后再通過上述3POLMC制備方式獲得雙熒光標(biāo)記的3PO-LMC。于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.濃度及粒徑：采用庫爾特分析儀測(cè)定3PO-LMC的粒徑和濃度。作為對(duì)照，測(cè)定MBs的粒徑和濃度。

3.載藥量測(cè)定：①藥物3PO標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱取3PO至容量瓶中，加入甲醇充分溶解并定容配置成1 mg/ml儲(chǔ)備液，用甲醇逐步稀釋，配置成濃度為120.0μg/ml、60.0μg/ml、30.0μg/ml、15.0μg/ml、7.5μg/ml

溶液。分別吸取以上溶液20μl，過濾后采用高效液相色譜儀測(cè)定樣品在304 nm波長(zhǎng)處的吸收峰面積。具體色譜條件為：流動(dòng)相為乙腈-水（體積比2.5∶97.5）添加0.1%TFA，Zorbax RP-C18反相色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm），流速1.0 ml/min，柱溫25℃，繪制3PO濃度-吸收峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。②3PO-LMC載藥量的測(cè)定。將1 ml微泡濃度為1×108/ml的3PO-LMC烘干，加入CHCl3以溶解并釋放出脂質(zhì)體內(nèi)容物，待揮發(fā)后加入甲醇稀釋溶解，通過HPLC和標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定3PO-LMC中3PO的含量。

（三）體外超聲顯影效果評(píng)估

取200μl微泡濃度為1×106/ml的MBs和3PO-LMC分別置于瓊脂模型中，以PBS為對(duì)照，使用彩色多普勒超聲診斷儀（15L8-S探頭，頻率7.0 MHz，機(jī)械指數(shù)0.18，幀頻16 Hz）進(jìn)行對(duì)比成像后，使用MCE 2.7軟件獲取超聲顯影強(qiáng)度（VI），評(píng)估其體外超聲顯影效果。

（四）體外超聲控釋藥物能力檢測(cè)

將3PO-LMC分為11組，每組3份（每份1 ml，1×108/ml），分別為空白對(duì)照組（不做任何處理）、裂解組（用1%Triton X-100溶液完全裂解微泡），余9組進(jìn)行超聲相應(yīng)處理，超聲強(qiáng)度分別為0.35、0.70、1.00 MPa，輻照時(shí)間分別為10、30、60 s，采用頻率1 MHz的聚焦探頭，占空比為1%的脈沖波輻照。輻照后離心去除上層液，再將各組溶液定容至1 ml，采用HPLC法測(cè)定3PO藥物的含量。釋放率=（CUS-C0）/（Ctx100-C0），其中CUS為超聲輻照后藥物的濃度，C0為空白對(duì)照組藥物的濃度，Ctx100為經(jīng)1%Triton X-100溶液完全裂解微泡后藥物的濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、3PO-LPs的粒徑、Zeta電位及包封率

由激光粒度儀測(cè)得3PO-LPs的粒徑為（174.77±3.62）nm，分散性良好，Zeta電位為（-22.75±0.63）mV，包封率為（90.74±1.67）%，制備重復(fù)性良好。

二、3PO-LMC的表征

制備的3PO-LMC混懸液為乳白色，微泡鏡下表現(xiàn)為球形，大小分布均勻，分散度較好，無明顯粘連和聚集；熒光顯微鏡下可同時(shí)見紅、綠色熒光（圖1），表明DiI標(biāo)記的3PO-LPs成功連接到FITC標(biāo)記的生物素化微泡表面。庫爾特分析儀測(cè)得MBs制備成3PO-LMC后，粒徑由（2.10±0.12）μm增大至（2.54±0.15）μm，而濃度由（1.33±0.08）×109個(gè)/ml減少至（0.86±0.06）×109個(gè)/ml，表明在制備的過程中微泡存在一定的耗損。

圖1 MBs、3PO-LPs及3PO-LMC顯微鏡下觀（×200）

三、3PO-LMC載藥量測(cè)定

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定3PO-LMC中3PO的濃度。在0.5～120.0μg/ml濃度范圍內(nèi)，3PO濃度與吸收峰面積呈良好的線性關(guān)系，見圖2；線性回歸方程為：y=99.009x-224.07，R2=0.9989。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得3PO-LMC載藥量為（99.58±6.63）μg/108個(gè)復(fù)合物。

圖2 3PO濃度-吸收峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線

四、體外超聲顯影特征

超聲對(duì)比成像探頭下，瓊脂模型中MBs和3POLMC的回聲較PBS明顯均勻強(qiáng)化，顯示出良好的超聲造影效果（圖3）；MBs和3PO-LMC的VI分別為（120.20±6.68）IU和（119.40±6.21）IU，均較PBS的VI［（17.68±5.53）IU］明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；3PO-LMC與MBs的VI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 MBs、3PO-LMC及PBS在瓊脂模型中的超聲造影圖

五、體外超聲控釋藥物

低頻超聲可以靶向破壞3PO-LMC釋放出藥物，在相同超聲強(qiáng)度下，藥物釋放率隨著超聲作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加（P＜0.05）；在相同超聲作用時(shí)間下，藥物釋放率隨著超聲強(qiáng)度的增加而增加（P＜0.05）；當(dāng)超聲強(qiáng)度為1.00 MPa、作用60 s時(shí)，3PO-LMC的藥物釋放率達(dá)到最高，為（90.93±1.79）%。見圖4。

圖4 3PO-LMC體外超聲控釋藥物柱狀圖

討 論

腫瘤新生血管已成為腫瘤治療的靶點(diǎn)，目前阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是減少新生血管形成的主要策略，然而即使同時(shí)使用多種阻斷劑，其臨床療效也有限，且存在明顯的毒副作用［5-7］。因此，需要尋找一種新的抗血管新生治療靶點(diǎn)，考慮到內(nèi)皮細(xì)胞85%的能量依賴于糖酵解［8］，以內(nèi)皮細(xì)胞代謝為目標(biāo)可能會(huì)成為一種抑制新生血管形成的新策略。3PO作為一種PFKFB3的小分子抑制劑，在內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的糖酵解，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的能量供應(yīng)［9］，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少血管的萌芽及新生血管的形成，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)達(dá)到治療腫瘤的目的［1-3］。但是目前相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［1，3］的給藥方式均為腹腔注射，其水溶性低，需與一些增溶劑如二甲基亞砜、無水乙醇等一起使用，易引起機(jī)體的局部組織壞死、神經(jīng)毒性甚至死亡，而且長(zhǎng)期全身使用藥物存在一定程度的毒副作用，限制了該藥物未來的臨床應(yīng)用。因此，如何將3PO藥物安全、有效、高選擇性地傳輸?shù)侥[瘤部位成為治療研究的難點(diǎn)。

超聲微泡作為一種超聲造影劑，不僅具有疾病診斷的作用，而且可以作為化療藥物或基因載體，在一定強(qiáng)度的超聲輻照下，局部發(fā)生空化效應(yīng)破裂，從而靶向控制釋放化療藥物或基因［9-10］。但是由于造影劑微泡外殼為較薄的脂質(zhì)膜或蛋白膜，在膜上能攜帶的藥物量或基因量有限，而且微泡中心為惰性氣體所占據(jù)，減少了微泡攜帶藥物或基因的能力，難以達(dá)到臨床治療的有效劑量。脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物作為一種良好的聲敏藥物載體，具有無創(chuàng)安全、有效、靶向等特點(diǎn)，研究［11-13］表明，該復(fù)合物載體對(duì)脂溶性藥物和水溶性藥物均具有較高的載藥量，不但滿足臨床腫瘤治療的用量需求，還可以將抗腫瘤藥物或基因特定傳輸?shù)侥[瘤部位，以增強(qiáng)腫瘤治療效果，體現(xiàn)了該復(fù)合物在體內(nèi)治療腫瘤的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)擬采用生物素-親和素非共價(jià)鍵結(jié)合方式制備3PO-LMC，并探討其一般特征、體外超聲顯影效果及超聲控制釋放能力。結(jié)果顯示，制備的3PO-LMC具有普通微泡形態(tài)，粒徑約（2.54±0.15）μm，符合臨床上微泡的使用要求，可以順利通過肺循環(huán)，而且實(shí)驗(yàn)中所采用的磷脂材料具有生物相容性良好的特性，保證了臨床使用的安全性；其中脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物制備所采用的生物素-親和素連接系統(tǒng)為高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合方式，難以被體內(nèi)蛋白溶解酶解離，具有高效、穩(wěn)定的特點(diǎn)，可以保證藥物的靶向輸送。理想的超聲造影劑應(yīng)具有良好的超聲顯影增強(qiáng)效果以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)有效的識(shí)別追蹤，本實(shí)驗(yàn)制備的3PO-LMC在體外瓊脂模型中可顯示出與普通微泡一致的超聲顯影效果，具有良好的超聲聲學(xué)特性，可為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供有效的識(shí)別追蹤及效果評(píng)價(jià)。

微泡在超聲波的作用下會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)［14］，即微泡周期性振蕩、膨脹、收縮以致內(nèi)爆等一系列動(dòng)力學(xué)過程，并伴隨著多種能量釋放?？栈?yīng)的大小與超聲能量密切相關(guān)，能量越高，空化效應(yīng)越明顯，對(duì)病變及周圍正常組織所造成的損傷越嚴(yán)重，從而造成嚴(yán)重的病理生理后果。對(duì)于載藥超聲造影劑，期望能在保證體內(nèi)局部藥物釋放率的同時(shí)，盡量避免或減少因超聲輻照對(duì)機(jī)體正常組織造成損害，保證使用的安全性。因此，在超聲介導(dǎo)載藥脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的治療過程中，超聲相關(guān)參數(shù)的合理選擇尤其重要。本實(shí)驗(yàn)中，在相同超聲強(qiáng)度條件下，藥物釋放率與超聲輻照時(shí)間呈正相關(guān)（P＜0.05）；而在相同超聲輻照時(shí)間下，藥物釋放率也與超聲強(qiáng)度呈正相關(guān)（P＜0.05），與既往研究［15-16］結(jié)果相符。而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲強(qiáng)度1.00 MPa、作用60 s時(shí)藥物釋放率達(dá)到最大［（90.93±1.79）%］，為后續(xù)低能超聲介導(dǎo)載3PO脂質(zhì)體微泡的體內(nèi)外治療研究提供超聲條件參考。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：①3PO-LMC在制備時(shí)需經(jīng)過多次離心洗滌，消耗較大，使得制備出的3PO-LMC濃度低于普通微泡造影劑；②盡管生物素-親和素連接方式是目前最有效的靶向結(jié)合系統(tǒng)，但是親和素受內(nèi)源性生物素競(jìng)爭(zhēng)，存在免疫原性，在臨床應(yīng)用可能會(huì)產(chǎn)生排異反應(yīng)；③3PO-LMC的治療效果尚有待體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證；④超聲參數(shù)有待于今后治療研究的進(jìn)一步優(yōu)化及評(píng)估，尤其對(duì)于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，需評(píng)估不同超聲參數(shù)對(duì)于周圍正常組織的損傷情況，以提高超聲使用的安全性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了3PO-LMC，其不僅在體外顯示出良好的超聲顯影效果，在超聲輻照下還可獲得良好的藥物釋放，為后續(xù)體內(nèi)外治療研究奠定了基礎(chǔ)，有望為體內(nèi)腫瘤治療提供一種新的、安全、有效的藥物載體和方法。