嚴(yán)夢迪 黃錦海 王勤美 高蓉蓉

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 325027

角膜膠原交聯(lián)術(shù)（Corneal collagen cross-linking，CXL）開始研究已有20余年的歷史，是目前臨床上控制圓錐角膜進(jìn)展的主要方法之一，找到相較于傳統(tǒng)去上皮方案更安全的跨上皮CXL方案已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。核黃素作為光敏劑在角膜中的濃度影響到CXL的療效和安全性，也是新型跨上皮CXL方案評估的重要指標(biāo)之一。目前，不同文獻(xiàn)中報道的CXL過程中核黃素濃度存在較大差異，所用檢測方法也不盡相同。筆者將闡述核黃素的理化性質(zhì)及其在CXL中的作用機(jī)制，及角膜中核黃素濃度檢測的重要性和檢測方法。

1 核黃素的理化性質(zhì)和CXL的應(yīng)用

核黃素又稱維生素B2，是一種重要的維生素，其分子式為C17H20N4O6，分子量376，由異四氧嘧啶環(huán)和核醇鏈組成（見圖1），微溶于水。

圖1.核黃素的結(jié)構(gòu)式Figure 1.Structural formula of riboflavin.

CXL于2003 年出現(xiàn)以來，用于治療進(jìn)展期圓錐角膜，可明顯增強(qiáng)角膜的生物力學(xué)性能，也用于治療感染性角膜炎[1，2]、角膜溶解[3]和角膜基質(zhì)水腫[4]等眼部病變。CXL以核黃素為光敏劑，在365 nm波長的紫外線-A（Ultraviolet A，UVA）照射下，核黃素從UVA中吸收能量，激發(fā)為三線態(tài)核黃素，CXL包括I型和II型機(jī)制：對于II型機(jī)制，三線態(tài)核黃素通過與三線態(tài)氧（3O2）的作用，產(chǎn)生活躍的單線態(tài)氧（1O2），可以與膠原的羰基相互作用；如果3O2耗盡，則I型機(jī)制占主導(dǎo)地位，即三線態(tài)核黃素直接作用于底物（膠原蛋白和蛋白聚糖）[5]。核黃素微溶于水，臨床上常用的是更易溶于水的核黃素-5'-磷酸，可被角膜中的酶轉(zhuǎn)化成為核黃素[6]。

2 角膜中核黃素濃度檢測的重要性

核黃素在CXL中具有2個重要功能：①作為光化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的光敏劑，促進(jìn)底物交聯(lián)；②作為UVA吸收劑保護(hù)角膜內(nèi)皮、晶狀體和視網(wǎng)膜等結(jié)構(gòu)免受UVA過度照射的傷害。

在UVA照射之前角膜基質(zhì)中核黃素的濃度，以及其在照射期間核黃素的有效消耗是保證CXL療效的2 個主要因素[7]。CXL過程中，在3 mW/cm2的輻照度下，核黃素以每分鐘1%～2%的速率發(fā)生光降解[8]，按每分鐘降解約2%計算，如果不補(bǔ)充核黃素，30 min后將降解約60%，因此照射過程中需要補(bǔ)充核黃素。O'Brart等[9]用不同濃度的核黃素溶液進(jìn)行豬眼快速CXL后進(jìn)行抗胃蛋白酶溶解實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)20 d后0.3%濃度組干重明顯大于0.05%濃度組，即核黃素濃度越高，抗溶解越好；他們還認(rèn)為基質(zhì)內(nèi)較高的核黃素濃度可導(dǎo)致前基質(zhì)UVA吸收增加，并在理論上減少角膜內(nèi)皮細(xì)胞的UVA輻射量，用于治療較薄的角膜。核黃素稀溶液的UVA吸收系數(shù)與其濃度呈線性相關(guān)，且在核黃素濃度達(dá)到0.1%時到達(dá)平臺期[10]，區(qū)別于先前研究中的0.04%[11]。對于目前臨床采用的UVA輻照量，最合適的基質(zhì)核黃素濃度尚有待研究。

3 角膜中核黃素濃度的檢測方法

核黃素的激發(fā)光波長范圍為440～500 nm，發(fā)射光波長范圍為510～550 nm[12]。通過檢測樣品內(nèi)核黃素的熒光強(qiáng)度，利用熒光強(qiáng)度與其濃度呈正比，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線得到核黃素濃度，可進(jìn)行定量分析。目前角膜中核黃素濃度的檢測方法大部分是基于這一特性，主要包括使用熒光顯微鏡進(jìn)行核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度分析、高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、分光光度法、無創(chuàng)性實(shí)時檢測、眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法等。檢測核黃素濃度的另一種原理是基于檢測質(zhì)譜中的特定峰，即基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜成像技術(shù)（Imaging mass spectrometry by matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI-IMS）。

3.1 利用熒光顯微鏡檢測角膜冰凍切片的核黃素濃度

目前大部分研究中檢測核黃素濃度是通過使用熒光顯微鏡對角膜進(jìn)行熒光成像，研究采用的共聚焦熒光顯微鏡激發(fā)光波長為488 nm或458 nm、發(fā)射光波長范圍為505～565 nm不等，雙光子熒光顯微鏡（Two-photon microscopy，TPM）激發(fā)光波長范圍為760～890 nm不等，發(fā)射光波長范圍為505～650 nm不等。熒光顯微鏡檢測的優(yōu)點(diǎn)是能檢測角膜全層的熒光強(qiáng)度以反映不同基質(zhì)深度的核黃素濃度，缺點(diǎn)是冰凍切片制作過程中包埋劑會溶解，在切片表面易發(fā)生核黃素的彌散遷移[13]。在冰凍切片制作完成后，應(yīng)盡快進(jìn)行熒光顯微鏡的拍攝，還可以用無熒光浸油覆蓋于切片表面以減少擴(kuò)散[13]。

有研究使用共聚焦熒光顯微鏡檢測CXL前后兔角膜基質(zhì)內(nèi)的核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)浸潤20 min和30 min后去上皮組核黃素濃度為0.036%和0.049%，跨上皮組濃度低于0.010%，CXL術(shù)后1 d，去上皮組角膜熒光強(qiáng)度下降約100%，跨上皮組下降約60%[14]。Gore等[13]對35 μm厚的兔角膜冰凍切片進(jìn)行TPM熒光成像，發(fā)現(xiàn)不同跨上皮核黃素制劑的基質(zhì)穿透能力均不如傳統(tǒng)去上皮方案，前基質(zhì)中，去上皮組、MedioCross TE組和Ricrolin組的核黃素濃度分別為0.090%、0.054%和0.031%，300 μm基質(zhì)深度處分別為0.075%、0.018%和0.016%。他們還用此方法比較了不同離子導(dǎo)入方案的核黃素滲透性，發(fā)現(xiàn)使用MedioCross TE溶液進(jìn)行2個周期的離子導(dǎo)入（即1 mA電流離子導(dǎo)入5 min—浸泡5 min—1 mA電流離子導(dǎo)入5 min—浸泡5 min），在離體兔眼中可達(dá)到與去上皮相似的滲透量[15]。Lanzini等[16]使用共聚焦熒光顯微鏡對5 μm厚的人供體角膜冰凍切片進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)采用離子導(dǎo)入浸潤法與傳統(tǒng)去上皮方案有相似的效果。

3.2 利用熒光顯微鏡檢測完整角膜的核黃素濃度

對完整角膜進(jìn)行成像可以避免核黃素在切片表面的擴(kuò)散，從而更準(zhǔn)確地對不同基質(zhì)深度的核黃素濃度進(jìn)行檢測。Sondergaard等[17]將去上皮后的完整豬眼角膜直接置于載玻片上，內(nèi)皮面朝向共聚焦熒光焦顯微鏡的物鏡，通過光學(xué)切片以10 μm的間隔記錄測量整個角膜的熒光強(qiáng)度，觀察到熒光強(qiáng)度在前50 μm內(nèi)達(dá)到峰值，然后急劇下降，在200 μm處降低至基線，并且隨著浸潤時間由10 min延長至20 min，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而由20 min延長至30 min，熒光強(qiáng)度無明顯變化，且當(dāng)核黃素濃度由0.1%增加到0.2%時，前基質(zhì)中的熒光強(qiáng)度明顯增加，但其深度分布不受時間和濃度的影響。Laggner等[18]使用共聚焦熒光顯微鏡觀察去上皮浸潤5、10、20 min后人供體角膜內(nèi)核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)20 min組濃度明顯高于另2組。Seiler等[19]使用TPM檢測核黃素溶液去上皮浸潤10 min后人供體角膜的核黃素濃度，測得后基質(zhì)濃度為0.035%，內(nèi)皮水平的濃度為0.015%，低于先前理論計算的0.025%[20]。Kampik等[21]使用TPM顯示，核黃素浸潤去上皮的豬角膜中30 min后基質(zhì)熒光信號呈空間均勻分布。有研究使用TPM測得在核黃素浸潤去上皮的豬角膜40 min后，角膜條帶橫截面的熒光信號已接近均勻，浸潤60 min后熒光信號隨深度呈線性下降，因此信號的降低是由于信號衰減而非核黃素濃度的空間變化，校正信號衰減后，核黃素濃度隨著浸潤時間的延長而增加，浸潤30min后最大組織濃度為0.094%（1.36 mg/ml），300 μm基質(zhì)深度處的平均濃度為0.086%（1.25 mg/ml），浸潤50 min后整個基質(zhì)濃度達(dá)到均勻[22]。

在跨上皮評估方面，Zhang等[23]以完整胚胎雞角膜為對象，通過共聚焦熒光顯微鏡觀察到肽NC-1059 對核黃素的跨上皮擴(kuò)散有明顯作用，且作用呈濃度和時間依賴，NC-1059為100 μmol/L濃度組的基質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于50 μmol/L濃度組，30 min后接近去上皮組。Arboleda等[24]使用共聚焦熒光顯微鏡研究離子導(dǎo)入對核黃素跨大鼠角膜上皮的作用，發(fā)現(xiàn)不含右旋糖酐的核黃素-磷酸鹽溶液在離子導(dǎo)入下可以跨上皮，但仍不如去上皮組，且此過程呈時間依賴性，認(rèn)為右旋糖酐的高分子量和高黏度阻礙了核黃素的跨上皮浸潤。

3.3 利用HPLC檢測角膜溶解液的核黃素濃度

HPLC的過程是將角膜在特定溶液里完全溶解，得到溶解液作為流動相被高壓輸液系統(tǒng)泵入含固定相的色譜柱，溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同，引起不同的排阻作用，因而使核黃素得以分離，進(jìn)入檢測器得到其濃度。HPLC可以單獨(dú)分離出核黃素，減少了其他物質(zhì)可能的干擾，相較于其他方法有更高的精準(zhǔn)度（可達(dá)到ng級別），但只能檢測角膜中平均核黃素濃度，不能直觀地描述核黃素的空間分布，而且由于不能將角膜表面的核黃素完全沖洗干凈而高估核黃素濃度[25]。

有研究使用HPLC測得5、15、30 min后保留上皮浸潤組供體人角膜中核黃素平均濃度分別為91.88、95.60、94.92 ng/g，而去上皮組分別為14.42、20.92、24.06 mg/g，表明角膜上皮阻礙了核黃素的浸潤[25]。Cassagne等[26]通過HPLC比較離子導(dǎo)入法與傳統(tǒng)去上皮法的兔眼角膜基質(zhì)和房水中的核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)離子導(dǎo)入組均低于去上皮組[角膜基質(zhì)：（936±313）ng/mlvs.（1 708±908）ng/ml，房水：（68±70）ng/mlvs.（1 497±1 168）ng/ml）]。Mastropasqua等[27]使用飛秒激光對核黃素浸潤后的人角膜分層并進(jìn)行HPLC，發(fā)現(xiàn)表層基質(zhì)中，傳統(tǒng)去上皮組的核黃素濃度為離子導(dǎo)入組的2倍，為保留上皮組的4倍濃度，3組濃度均隨深度增加而明顯下降，在中、后基質(zhì)中無明顯差異。Ostacolo等[28]通過HPLC在離體豬角膜中觀察到d-α-生育酚聚乙二醇1 000琥珀酸酯（Vitamin E-tocopherylpolyethylene glycol succinate，VE-TPGS）對核黃素的跨上皮穿透具有影響作用，在核黃素溶液內(nèi)加入0.5% VE-TPGS，浸潤20 min后角膜內(nèi)核黃素濃度可以接近去上皮方案。

3.4 利用紫外可見光分光光度計檢測完整角膜的核黃素濃度

物質(zhì)中的分子和原子吸收入射光中的某些波長的光能量，發(fā)生相應(yīng)的分子振動能級躍遷和電子能級躍遷。每種物質(zhì)的分子、原子構(gòu)成和空間結(jié)構(gòu)各異，因此具有獨(dú)特的吸收光譜曲線，曲線上的特征波長處的吸光度可用于定性和定量分析該物質(zhì)的含量。紫外可見光分光光度計相較其他方法操作更簡單，但不能提供核黃素隨深度變化的趨勢。Iselin等[29]使用該方法（激發(fā)光譜420～490 nm、吸收光譜530～630 nm）檢測到15 min內(nèi)人工前房中核黃素平均濃度從5 ng/mL增加到903 ng/mL，30 min后達(dá)到1 089 ng/mL，證明核黃素可以穿透人供體角膜。有研究同時聯(lián)合應(yīng)用TPM和分光光度法測量人供體角膜CXL過程中基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，浸潤30 min后，在100～250 μm基質(zhì)深度平均峰值濃度為0.020%±0.001%，在250～240（320±53）μm的基質(zhì)深度范圍濃度幾乎恒定，然后向內(nèi)皮方向逐漸降低，后基質(zhì)中濃度為0.016%±0.001%，常規(guī)UVA照射和快速UVA照射后，濃度分別均勻下降87%±2%和67%±3%[30]。另一研究使用此方法測得核黃素納米制劑跨上皮浸潤和標(biāo)準(zhǔn)溶液去上皮浸潤后，人供體角膜基質(zhì)中核黃素平均濃度分別為0.008%±0.003%和0.017%±0.001%，UVA照射后，2組平均消耗量分別為52%±13%和67%±2%[31]。Lombardo等[32]使用分光光度法測得含促滲劑的低滲核黃素可通過完整的人角膜上皮滲入基質(zhì)，平均濃度為0.004%，但不如去上皮組（0.012%），在加入15%右旋糖酐后，核黃素不能通過完整角膜上皮，認(rèn)為可能是因?yàn)橛倚囚母叻肿恿亢透唣ば浴?/p>

3.5 利用自行研發(fā)的儀器無創(chuàng)實(shí)時檢測角膜的核黃素濃度

CXL治療結(jié)果的不確定性與患者的角膜組織有關(guān)，例如滲入角膜基質(zhì)的核黃素量和照射過程中核黃素的消耗等可能存在個體差異，目前缺少針對每例患者的個性化治療。如果在治療過程中能實(shí)時監(jiān)測患者角膜內(nèi)核黃素濃度，則有可能實(shí)現(xiàn)個性化CXL。Lombardo等[7]研發(fā)了一臺儀器，能非侵入實(shí)時監(jiān)測治療過程中的基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，他們利用17片人供體角膜進(jìn)行CXL，UVA照射期間通過分光光度法測量得到實(shí)時吸光度值，根據(jù)校準(zhǔn)曲線得到基質(zhì)內(nèi)核黃素濃度，發(fā)現(xiàn)浸潤30 min后基質(zhì)中平均濃度為0.014%±0.003%，UVA照射30 min后降為0.003%±0.001%，并且角膜生物力學(xué)增強(qiáng)的程度與照射前基質(zhì)內(nèi)核黃素量以及照射時核黃素的消耗量明顯相關(guān)。Lombardo[33]設(shè)計了一個由UVA光源、紅-綠-藍(lán)照相機(jī)（用于治療過程中獲取角膜的熒光圖像，相機(jī)的綠色信號與核黃素的熒光光譜重疊）和一臺計算機(jī)（用于管理整體操作和原始數(shù)據(jù)處理）組成的設(shè)備，用于無創(chuàng)性地實(shí)時測定人供體角膜中核黃素平均濃度，浸潤30 min后，基質(zhì)內(nèi)平均濃度為0.015%±0.003%，2種UVA照射方案（3 mW/cm2×30 min和9 mW/cm2×10 min）的基質(zhì)內(nèi)總的核黃素濃度均呈指數(shù)下降，消耗動力學(xué)曲線無明顯差異。然而，上述研究無法提供核黃素濃度隨角膜深度變化的規(guī)律，且處于離體實(shí)驗(yàn)階段，準(zhǔn)確性和重復(fù)性有待進(jìn)一步研究。

3.6 利用眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法檢測在體角膜的核黃素濃度

Rubinfeld等[34]使用眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察法評估兔眼角膜內(nèi)核黃素含量，并制定了分級方案：0級為不可見綠色，1級為剛剛可見的淡綠色，2級為強(qiáng)于1級的可見綠色，3級為明顯的綠色，4級為明亮的綠色，5級為強(qiáng)而明亮的綠色，該方法結(jié)果與HPLC高度相關(guān)（R2=0.940），但是結(jié)果依賴于檢查者的主觀評估，重復(fù)性和再現(xiàn)性尚未得到驗(yàn)證，未得到普遍應(yīng)用。

3.7 利用MALDI-IMS檢測角膜冰凍切片的核黃素濃度

MALDI-IMS是一種相對較新的技術(shù)，MALDI離子源由具有紫外發(fā)射的氮激光形成，激光將能量提供給基質(zhì)晶體引起解吸和電離，質(zhì)譜分析儀收集并檢測基質(zhì)和分析物（離子形式）質(zhì)譜中的特定峰（組織學(xué)分辨率約50 μm），從而識別化合物或其代謝物，已用于眼部的藥代動力學(xué)研究。Vinciguerra等[35]使用MALDI-IMS評估傳統(tǒng)去上皮法、離子導(dǎo)入法和保留上皮法在兔角膜和人供體角膜中核黃素的濃度和分布，將20 μm厚的冰凍角膜切片干燥2 h后涂上MALDI基質(zhì)，進(jìn)行高分辨MALDI質(zhì)譜儀分析，前2組在角膜各深度和角膜緣處均檢測到核黃素信號，但離子導(dǎo)入組最深層的濃度稍低于去上皮組，而保留上皮組的核黃素信號極微弱。

4 總結(jié)

角膜內(nèi)核黃素濃度及其分布的準(zhǔn)確檢測對于CXL安全性和有效性的評估，新型跨上皮CXL方案的評估以及個性化手術(shù)方案的設(shè)計均至關(guān)重要。目前研究中不同測量方法得出的結(jié)果差異較大，可能與測量原理、采用的組織和樣品的制備有關(guān)。核黃素的無創(chuàng)實(shí)時檢測方面已有少量的離體研究，但仍處于初步探索階段，迫切需要在體的檢測技術(shù)以滿足基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用需求，并提供可靠的工具。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明嚴(yán)夢迪：收集文獻(xiàn)資料并歸納分析；撰寫論文；根據(jù)修改意見進(jìn)行論文修改。黃錦海、王勤美：對論文的知識性內(nèi)容作批評性審閱。高蓉蓉：參與選題設(shè)計；指導(dǎo)資料的分析和解釋；參與論文的修改