姚 婷 趙 鋆

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203）

中醫(yī)學(xué)認為肥胖與氣虛、痰、濕、瘀有關(guān)。《丹溪心法》記載：“肥人多痰濕?！薄夺t(yī)學(xué)法門》亦云：“肥白人多濕痰，黑瘦人多火熱?！贬槍Ψ嗜硕嘤小疤禎瘛钡奶攸c，臨床常用二陳湯加減治療超重或肥胖患者。二陳湯組方出自《太平惠民和劑局方》，有燥濕化痰、理氣和中之效[1]。目前，已有較多的臨床研究發(fā)現(xiàn)二陳湯對單純性肥胖或繼發(fā)性肥胖有較好的療效，能調(diào)節(jié)糖脂代謝[2-3]。此外，腸道菌群是近年來的研究熱點，人體的代謝產(chǎn)物約有99%來自位于遠端結(jié)腸的細菌[4]。在一定程度上，腸道菌群被看作是內(nèi)分泌器官[5]，它可通過分泌代謝產(chǎn)物改變腸道通透性，代謝物進入血液及淋巴系統(tǒng)后影響機體。一旦菌群失調(diào)，疾病也隨之而來[6]。曙光醫(yī)院兒科化裁二陳湯為加味二陳湯，用于兒童肥胖的干預(yù)，效果較好。本研究觀察了加味二陳湯對肥胖SD幼鼠肝臟組織中Toll樣受體4（TLR4）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）mRNA表達以及對幼鼠腸道菌群的影響，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物8只SD孕鼠，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證：必凱SCXK（滬）2013-0016，實驗動物使用許可證：SYXK（滬）2014-0008。孕鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心清潔級動物房。孕鼠自由飲食，室溫保持在24～26 ℃，待產(chǎn)。產(chǎn)出仔鼠后，哺乳21 d。本實驗符合上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利與倫理相關(guān)規(guī)定，倫理編號：PZSHUTCM190531005。

1.2 主要試劑與儀器普通飼料，上海帆泊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；高脂飼料（粗蛋白20%、脂肪40%、碳水化合物40%），上海帆泊生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；RNA提取液（批號：G3013），武漢賽維爾生物科技；測定引物由上海擎熙生物科技有限公司提供。JY92-Ⅱn型超聲細胞粉碎機（寧波新芝生物）；Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機（Heal Force）；KH-Ⅲ型全自動研磨儀（武漢賽維爾生物）；7300熒光定量PCR儀（ABI）；NanoDrop 2000型超微量分光光度計（Thermo）。

1.3 藥物加味二陳湯，藥物組成：茯苓9 g，陳皮6 g，制半夏9 g，甘草3 g，丹參9 g，荷葉9 g，枳實9 g，檳榔9 g，山楂9 g。飲片由上海虹橋中藥飲片有限公司提供，按質(zhì)量比加8倍水浸泡0.5 h，文火煎煮2次，第一次40 min，第二次30 min，兩次藥汁合并后4層紗布過濾2次，水浴鍋70 ℃濃縮至含生藥量0.435 g/mL，高壓滅菌后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 動物造模臨床研究提示兒童肥胖具有明顯的遺傳傾向[7]，本實驗參照親代大鼠肥胖和高脂飲食狀態(tài)影響子代，形成體脂連續(xù)性肥胖模型，建立幼齡SD大鼠營養(yǎng)性肥胖模型[8]。將8只SD孕鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d，2只孕鼠以普通飼料喂養(yǎng)，6只孕鼠以高脂飼料喂養(yǎng)，孕鼠按1只/籠待產(chǎn)直至哺乳期。產(chǎn)出仔鼠多于8只時，仔鼠按8只/籠的喂養(yǎng)密度進行哺乳，余仔鼠剔除，21日齡斷乳后剔除雌鼠，將剩余30只雄鼠分籠。取普通飼料喂養(yǎng)的孕鼠所生仔鼠10只為正常組，同樣進食普通飼料。取高脂飼料喂養(yǎng)的孕鼠所生仔鼠為造模組，給予高脂飼料，繼續(xù)喂養(yǎng)1周，體質(zhì)量超過正常組體質(zhì)量均數(shù)20%的仔鼠為造模成功。

2.2 分組與給藥將造模組造模成功的20只幼齡SD肥胖大鼠隨機分為高脂組和二陳湯組，每組10只，繼續(xù)喂以高脂飼料。根據(jù)人與大鼠體表面積換算比，按公式計算出大鼠給藥劑量。大鼠給藥劑量（mg/kg）=系數(shù)（6.25）×人的劑量（mg/kg）。以成人正常給藥劑量換算大鼠給藥劑量為18.125 g/kg。二陳湯組大鼠每日灌胃給予加味二陳湯18.125 g/kg，正常組和高脂組大鼠每日灌胃給予等量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)灌胃6周。

2.3 指標檢測

2.3.1 熒光定量PCR檢測肝臟組織中TLR4、MCP-1 mRNA表達烏來糖麻醉各組幼鼠，分離肝臟組織轉(zhuǎn)入液氮中保存。按Trizol Reagent試劑盒說明書，檢測肝臟組織中RNA濃度及純度。檢測項目：TLR4、MCP-1。引物序列：MCP-1（5’-TGCAGGTCTC TGTCACGCTTC-3’）、TLR4（5’-GGATTTATCCAGG TGTGAAATTGA-3’）。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min變性后，分別以95 ℃、15 s和60 ℃、60 s循環(huán)40次。溶解曲線為75～95 ℃，每20 s升溫1 ℃。最后用ΔΔCT法表達：A=CT（目的基因，待測樣本）-CT（內(nèi)標基因，待測樣本）；B=CT（目的基因，對照樣本）-CT（內(nèi)標基因，對照樣本）。K=A-B，表達倍數(shù)=2-K。

2.3.2 16S rDNA擴增子測序分析糞便中腸道菌群烏來糖麻醉各組幼鼠，收集幼鼠腸道中糞便，轉(zhuǎn)入液氮中保存。首先，測序得到原始數(shù)據(jù)（raw data），并對其進行拼接、過濾后得到有效數(shù)據(jù)（clean data）。然后基于有效數(shù)據(jù)進行可執(zhí)行的分類操作單位（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析。根據(jù)OTUs聚類結(jié)果，對每個OTU的序列做物種注釋，通過OTUs豐度、Alpha多樣性計算等分析，獲得樣本內(nèi)以及不同樣本或類群間相關(guān)信息。此外，對OTUs進行多序列比對，構(gòu)建樣本聚類樹以探索群落結(jié)構(gòu)的差異情況。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)處理組間采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有腸道菌群樣本實驗數(shù)據(jù)采用Uprse v7.0.1001軟件進行聚類分析。對OTUs序列進行注釋，并用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫（設(shè)定閾值為0.8～1）進行物種注釋，統(tǒng)計每個樣品在不同分類水平上的群落組成。利用MUSCLE（Version 3.8.31）軟件進行多序列比對，獲得所有OTUs序列的發(fā)生關(guān)系。使用Qiime軟 件（Version 1.9.1）計 算observed-speciess、chao1、simpson指數(shù)，計算Unifrac距離，做非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析并繪制聚類樹圖。使用R軟件（Version 2.15.3）繪制Alpha多樣性指數(shù)的物種積累曲線，進行Alpha多樣性指數(shù)和Beta多樣性指數(shù)的組間差異分析，分別進行有參數(shù)檢驗和非參數(shù)檢驗，選用Tukey檢驗和agricolae包的wilcox檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠TLR4、MCP-1表達量比較與正常組比較，高脂組幼鼠肝臟組織TLR4表達量顯著升高（P＜0.05），MCP-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與高脂組比較，二陳湯組幼鼠肝臟組織TLR4表達量明顯降低（P＜0.05），MCP-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上述指標二陳湯組與正常組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肝臟組織TLR4、MCP-1表達量比較（±s）

表1 各組大鼠肝臟組織TLR4、MCP-1表達量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與高脂組比較，#P＜0.05。

3.2 各組大鼠腸道菌群檢測數(shù)據(jù)比較

3.2.1 OTUs數(shù)量對所有樣本的有效數(shù)據(jù)以97%的一致性（identity）進行OTUs聚類，并對其代表序列進行物種注釋。各組數(shù)量上差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。根據(jù)OTUs代表序列的物種注釋結(jié)果，分析各組間的OTUs并繪制韋恩圖，見圖1。由圖1可見，3組含共有OTUs為451個，正常組與高脂組共有44個，正常組與二陳湯組共有53個，高脂組與二陳湯組共有73個。正常組特有的OTUs為39個，高脂組53個，二陳湯組106個。

表2 各組大鼠腸道菌群OTUs數(shù)量比較（±s）

表2 各組大鼠腸道菌群OTUs數(shù)量比較（±s）

圖1 各組大鼠腸道菌群共有、特有的OTUs數(shù)量（單位：個）

3.2.2 物種相對豐度情況選取每組樣本在科（family）水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱狀圖，見圖2。在科水平上，主要包括Lactobacillaceae（乳 酸 桿 菌 科）、Lachnospiraceae（毛 螺 菌 科）、Erysipelotrichaceae（韋 榮 球 菌 科）、Muribaculaceae（擬桿菌科）、Peptostreptococcaceae（消化鏈球菌科）等。其中擬桿菌科在各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但從分布占比上觀察到高脂組擬桿菌科比例最小，其次為二陳湯組，正常組比例最大，見表3。

圖2 各組大鼠腸道菌群在科水平上物種相對豐度分布

表3 各組大鼠腸道菌群在科水平上的擬桿菌科的豐度分布占比

3.2.3 Alpha多樣性分析Alpha Diversity主要用于分析樣本內(nèi)的群落多樣性和豐富度，包括observed_speciess、shannon、simpson、chao1、ACE等[9]。其 中，observed_speciess、chao1與物種豐富程度呈正比，即指數(shù)越大，表明物種豐富程度越高；而simpson指數(shù)越大，表明群落每個種類分布的均勻度越高，提示多樣性越低。由表4、圖3可見，與正常組比較，高脂組observed_speciess和chao1指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；二陳湯組observed_speciess指數(shù)明顯高于高脂組（P＜0.05），chao 1指數(shù)與高脂組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），observed_speciess和chao1指數(shù)與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組simpson指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。該結(jié)果顯示，各組間的物種群落多樣性無明顯差異。各組的豐富度，高脂組最低，二陳湯組其次，正常組最高。

表4 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析

圖3 各組大鼠腸道菌群Alpha多樣性分析圖

3.2.4 Beta多樣本比較分析Beta多樣本分析是對不同樣本間的群落構(gòu)成進行比較分析。利用OTUs之 間的 關(guān) 系，計 算Unifrac距 離[10-11]。Unifrac距離是一種利用各樣本微生物序列間的進化信息計算樣本間距離，獲得一個距離矩陣。其值越小，表示這兩個樣本在物種多樣性方面的差異越小。由圖4可見，在非加權(quán)的Unifrac距離熱圖中，正常組與二陳湯組存在差異最?。?.271），高脂組與二陳湯組存在差異最大（0.432），正常組與高脂組存在差異稍大（0.420）。為了研究不同樣本群落間的相似性，可通過構(gòu)建樣本的聚類樹來描述。在環(huán)境生物學(xué)中，UPGMA（unweighted pairgroup method with arithmetic mean）是一種較為常見的聚類分析方法[12]。以非加權(quán)Unifrac距離矩陣做UPGMA聚類分析，并將聚類結(jié)果與各樣本在門水平上的物種相對豐度進行整理、匯總，見圖5。在門水平上，正常組與二陳湯組群落具有相似性，其相似性與高脂組不同。

圖4 各組大鼠腸道群落非加權(quán)Unifrac距離熱圖

圖5 各組大鼠腸道菌群UPGMA聚類樹圖

4 討論

近年來，兒童超重和肥胖問題日益引起社會各界關(guān)注，根據(jù)2014年全國學(xué)生體質(zhì)與健康調(diào)查結(jié)果，7～18歲學(xué)生超重肥胖率已上升至19.4%，并持續(xù)增長[13]。二陳湯原方組成為半夏、橘紅、白茯苓、甘草，方中祛痰藥與理氣藥相伍，燥濕藥與滲濕藥、生津藥配合，共奏健脾、理氣、燥濕、化痰之功[1]。加味二陳湯是在二陳湯基礎(chǔ)上進行藥味劑量變化和加減而成，前期臨床研究已證實其治療兒童單純性肥胖具有較好的療效[3]。

Toll樣受體在調(diào)節(jié)腸道菌群引起的炎癥反應(yīng)中起著重要作用[14]。關(guān)于“肥胖-腸道菌群-TLRs”三者間的交互作用關(guān)系，研究者揭示了TLRs是腸道黏膜免疫識別與清除病原菌的關(guān)鍵分子[15-16]。其中，TLR4是革蘭陰性菌脂多糖的重要結(jié)合配體，在肥胖大鼠腸黏膜上皮細胞中過度表達[17]，它與肥胖性炎癥反應(yīng)直接相關(guān)。肥胖可導(dǎo)致腸壁完整性降低，使細菌脂多糖與脂肪酸滲漏入血液中，激活TLR4與全身炎癥反應(yīng)；脂肪酸也可以介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而激活TLR4。因此，TLR4是肥胖-腸道菌群-TLRs的關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點。李敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)肥胖兒童出現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的慢性炎癥狀態(tài)，分析提示TLR4及下游途徑MyD88、TRAM與體質(zhì)量指數(shù)相關(guān)，但與血糖、胰島素抵抗無相關(guān)性。SANTONI M等[19]研究指出，TLR4在肥胖兒童體內(nèi)表達異常增多。本實驗發(fā)現(xiàn)，肥胖幼鼠肝臟組織中TLR4表達量較高，與上述報道一致。而二陳湯組TLR4表達量明顯低于高脂組（P＜0.05），提示加味二陳湯能降低肥胖幼鼠肝臟組織中TLR4的表達量，從而干預(yù)肥胖性炎癥反應(yīng)。

TLR4活化在免疫、炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色，可通過MyD88依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活核因子-κB（NF-κB），向下啟動MCP-1等多種炎性因子的轉(zhuǎn)錄與合成[20]。MCP-1屬于單核巨噬細胞重要趨化因子，上調(diào)MCP-1可促進肥胖和胰島素抵抗[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)，肥胖幼鼠肝臟組織中MCP-1無明顯上調(diào)，加味二陳湯干預(yù)后也無明顯變化。分析原因可能是因脂肪組織中多種炎性因子、趨化因子富集交互作用，吸引單核巨噬細胞等炎性細胞聚集，釋放出更多的趨化及炎性因子。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞遷移因子由病態(tài)的脂肪組織分泌，抑制組織中的巨噬細胞游走，增強巨噬細胞浸潤，促進代謝紊亂、炎癥狀態(tài)等肥胖相關(guān)的病理過程[22]。而本次實驗樣本為肝臟組織，故組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

對肥胖SD幼鼠腸道菌群的研究結(jié)果表明，正常組、高脂組和二陳湯組獲得腸道菌群總數(shù)無明顯差異，處理過濾后獲得有效數(shù)據(jù)，二陳湯組的特有OTUs較其他2組多，說明湯藥干預(yù)后，能夠增加幼鼠腸道中的菌群數(shù)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在科水平上，Muribaculaceae（擬桿菌科）在各組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但從數(shù)值上觀察到正常組比例最大，其次為二陳湯組，高脂組最低，說明擬桿菌在正常幼鼠中數(shù)量最多，在肥胖幼鼠中數(shù)量最少，經(jīng)湯藥干預(yù)后，擬桿菌有明顯增加，提示加味二陳湯可能通過增加肥胖SD幼鼠腸道菌群中擬桿菌的數(shù)量，從而改善腸道菌群失調(diào)的趨勢。WALKER A W等[23]研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌可以明顯抑制脂肪細胞增長，增加肥胖者腸道中擬桿菌數(shù)量有望用于治療肥胖。此外，擬桿菌門可促進宿主分解多糖，促進腸黏膜的血管再生和免疫系統(tǒng)發(fā)育，有助于維持腸道微生態(tài)平衡[24]。因本次動物實驗經(jīng)費有限，待今后增加樣本量，以進一步證實此實驗結(jié)果。

本研究通過Alpha多樣性分析，發(fā)現(xiàn)與正常幼鼠比較，肥胖幼鼠腸道菌種數(shù)減少，但多樣性無明顯差異，經(jīng)加味二陳湯干預(yù)后雖菌種數(shù)量增加，但多樣性仍無明顯差異。一般來說，樣本中物種的多樣性包括兩個方面，一是種類不確定的多少，二是每個種類分布的均勻度。本次實驗多樣性以simpson指數(shù)為準，因該指數(shù)描述的是從一個群落種連續(xù)兩次抽樣所得到的個體數(shù)屬于同一種的概率[25]。而shannon指數(shù)側(cè)重于物種種類的不確定性多少來觀察多樣性，不確定物種越多，提示多樣性越好。本次實驗觀察到加味二陳湯對肥胖幼鼠腸道菌種數(shù)量有增加作用，為避免物種數(shù)量可能影響到多樣性結(jié)果，故選用simpson指數(shù)。觀察Beta多樣本比較分析中的非加權(quán)Unifrac距離熱圖和UPGMA聚類樹圖，均顯示正常組與二陳湯組組間具有相似性，但其相似性與高脂組不同，提示肥胖SD幼鼠腸道菌群的群落構(gòu)成與正常幼鼠存在不同，而加味二陳湯能夠調(diào)節(jié)肥胖幼鼠的腸道細菌群落構(gòu)成近似于正常幼鼠。

腸道菌群與肥胖、2型糖尿病等糖脂代謝性疾病的關(guān)系是闡明中醫(yī)藥作用機制的研究熱點。目前關(guān)于腸道菌群的檢測，要求每個樣本組中至少含有3個（包括3個）以上的單樣本，方有檢測意義。因本次課題經(jīng)費有限，故隨機取各組3只雄鼠糞便樣本完成腸道菌群檢測。

通過本次動物實驗，揭示了加味二陳湯能夠降低幼齡SD肥胖大鼠肝臟組織中Toll樣受體4表達量，增加腸道中擬桿菌數(shù)量，改善腸道菌群失調(diào)，為進一步研究加味二陳湯治療肥胖性炎癥方向以及“肥胖-腸道菌群-TLRs”三者相互作用機制提供參考依據(jù)。下一步研究將重點觀察加味二陳湯對肥胖幼鼠腸上皮細胞中TLR4的調(diào)節(jié)作用以及相關(guān)炎癥基因表達情況。