馬曉馳 金諾 劉佳萌 孫晶 賈寧 孫玉鳳 范蓓

摘 要：氨基甲酸乙酯廣泛存在于發(fā)酵食品中，2007年被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2A類致癌物。國(guó)內(nèi)外研究者開發(fā)出了適用于不同樣品條件和研究目的檢測(cè)方法。分類介紹了近年來國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的傳統(tǒng)和快速檢測(cè)氨基甲酸乙酯方法，包括色譜法、光譜法以及其他檢測(cè)方法，對(duì)這些方法在發(fā)酵食品中的應(yīng)用特點(diǎn)和檢測(cè)效果進(jìn)行綜述，并對(duì)我國(guó)未來氨基甲酸乙酯檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：氨基甲酸乙酯;發(fā)酵食品;傳統(tǒng)檢測(cè);快速檢測(cè)

氨基甲酸乙酯（EC）在工業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-4]，而在食品領(lǐng)域，EC則是發(fā)酵食品在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中不可避免產(chǎn)生的副產(chǎn)物，常見于黃酒、醬油和腐乳等食品中[5]。不同發(fā)酵食品中EC的形成機(jī)理不同，但大多與酒精和微生物代謝相關(guān)[6]。EC的主要前體物質(zhì)有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氫氰酸以及焦碳酸二乙酯等，這些前體物質(zhì)在微生物的作用下與乙醇反應(yīng)產(chǎn)生EC[7-10]。動(dòng)物毒性實(shí)驗(yàn)表明，EC是一種多點(diǎn)位致癌物，短期、大劑量注射可誘發(fā)嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)肺癌、皮膚癌等腫瘤[11-12]。給非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物長(zhǎng)期每日口服EC，可誘發(fā)其出現(xiàn)肺腺癌和血管瘤等[13]。EC在CYP450的作用下分別轉(zhuǎn)化為N-羥基氨基甲酸乙酯和乙烯基氨基甲酸乙酯，這兩種物質(zhì)能引起DNA、RNA結(jié)構(gòu)損傷，并使機(jī)體中蛋白質(zhì)發(fā)生加聚反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)癌癥[14-15]。因?yàn)镋C在人體中的代謝機(jī)理與其在嚙齒類動(dòng)物中的原理十分相似，所以對(duì)于人類而言，EC是一種潛在的致癌物質(zhì)，2007年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將EC由2B類提高為2A類致癌物[16]。因此，對(duì)發(fā)酵食品中的EC進(jìn)行定性和定量分析檢測(cè)具有重大意義，本文將對(duì)發(fā)酵食品中EC的標(biāo)準(zhǔn)與各種檢測(cè)方法進(jìn)行介紹與評(píng)價(jià)，并對(duì)其未來發(fā)展進(jìn)行展望。

1 國(guó)內(nèi)外酒飲料中氨基甲酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)

早在1985年，加拿大衛(wèi)生管理部門就根據(jù)不同酒飲料中EC含量差異，對(duì)多種酒飲料中的EC制定了不同等級(jí)的強(qiáng)制限量：葡萄酒≤30 μg/L、強(qiáng)化酒≤100 μg/L、蒸餾酒≤150 μg/L、清酒≤200 μg/L、白蘭地≤400 μg/L[17];1989年，美國(guó)食品藥品管理局對(duì)酒類中的EC制定了推薦限量標(biāo)準(zhǔn)：葡萄酒≤15 μg/L、強(qiáng)化酒≤60 μg/L[18];法國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)為蒸餾酒≤150 μg/L、白蘭地≤1 000 μg/L;捷克的限量標(biāo)準(zhǔn)與加拿大基本一致;韓國(guó)、德國(guó)和瑞士等國(guó)家也對(duì)個(gè)別酒類制定了限量標(biāo)準(zhǔn);2002年，聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織規(guī)定酒飲料中的EC限量為20 μg/L[19] （表1）。

目前，我國(guó)出臺(tái)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（現(xiàn)行有效）有三部，分別為《GB 5009.223—2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》《SN/T 0285—2012 出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測(cè)方法 氣相色譜—質(zhì)譜法》《GB/T 34266—2017 黃酒中氨基甲酸乙酯預(yù)防控制技術(shù)措施指南》[18-20]。雖然我國(guó)對(duì)食品中EC的檢測(cè)和防控較為關(guān)注，但是沒有相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，我國(guó)發(fā)酵食品中EC含量最高的前三名分別是黃酒、腐乳和醬油，平均濃度分別為307.2 、123 、108 μg/L，其次是料酒87 μg/L、白酒72 μg/L、食醋51 μg/L[21-24]，這對(duì)于我國(guó)發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)和國(guó)民健康都具有一定的不良影響。

2 氨基甲酸乙酯檢測(cè)方法

為了滿足不同發(fā)酵食品基質(zhì)中的EC檢測(cè)，研究者已經(jīng)開發(fā)出了多種定性和定量的EC檢測(cè)方法以滿足不同需求（表2）。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法為色譜法，基于大型分析儀器，能夠?qū)κ称分械腅C進(jìn)行準(zhǔn)確且靈敏的檢測(cè)[25];隨著食品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和實(shí)際生產(chǎn)生活的需要，研究者也開發(fā)出了更加便捷和快速的檢測(cè)方法[26]，如酶法、免疫分析法和分子印跡法等。

2.1 色譜法

EC色譜法檢測(cè)技術(shù)大多是基于液相色譜和氣相色譜按照不同的檢測(cè)需求與不同檢測(cè)器聯(lián)用，對(duì)EC痕量檢測(cè)，采取凈化/濃縮預(yù)處理程序，以確保方法靈敏度高、重復(fù)性好、適用性廣，能夠滿足不同基質(zhì)中EC定量分析[26]。

2.1.1 液相色譜 Alberts等[27]運(yùn)用反相固相萃取，建立了液相色譜-大氣壓化學(xué)離子化-串聯(lián)質(zhì)譜的EC檢測(cè)方法，檢出限為0.25 μg/L，分別對(duì)葡萄酒和烈性酒中的EC進(jìn)行定量分析，平均回收率為94.5%。該法雖然靈敏度和可重復(fù)性高，但是較為耗費(fèi)時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。Leca等[28]以液-液微萃取法用少量乙酸乙酯提取強(qiáng)化葡萄酒中的EC，運(yùn)用反相液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜，以EC的二次離子躍遷對(duì)EC進(jìn)行定量，檢出限和定量限分別為0.17 、0.52 μg/L，回收率為93%～114%，且重現(xiàn)性較好。該方法有效減少了樣品前處理時(shí)有機(jī)溶劑的使用量，同時(shí)具有較好的靈敏度。Ojeda等[29]運(yùn)用液相色譜-熒光法檢測(cè)EC，使用高氯酸酸化樣品，用9-呫噸醇對(duì)EC進(jìn)行自動(dòng)柱前衍生使其具有熒光性質(zhì)，用熒光檢測(cè)器進(jìn)行捕獲，進(jìn)而計(jì)算出EC含量，該法檢出限為0.52 μg/L，應(yīng)用于葡萄酒中EC的檢測(cè)，回收率為101%～103%。這種通過衍生化進(jìn)行樣品前處理的方法，極大地縮短了前處理時(shí)間，使樣品檢測(cè)前處理過程更加快速簡(jiǎn)便。

2.1.2 氣相色譜 GC-MS結(jié)合了化合物的分離和鑒定，并具有高分辨率和重現(xiàn)性的特點(diǎn)。Ma等[30]建立了一種基于乙醇和K2HPO4水溶液兩相系統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，用于定量紅酒中EC，研究者優(yōu)化了萃取時(shí)間、溫度、pH和乙醇濃度，該方法的線性工作范圍是10～100 μg/L，檢出限和定量限分別為2.8、9.2 μg/L。Xian等[31]建立了一種基于冰浴輔助氫氧化鈉純化的GC-MS/MS法，檢測(cè)啤酒和黃酒中的EC，樣品在加入內(nèi)標(biāo)后用乙腈-乙酸乙酯萃取，在冰浴條件下用NaOH純化濃縮后上機(jī)檢測(cè)，該法線性范圍為2～200 μg/ L，檢出限為0.1～0.5 μg/ kg，定量限為0.5～1.5 μg/ kg，回收率為81.5%～121.0%。趙依芃等[32]建立了穩(wěn)定同位素稀釋-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乳酪、腐乳和酸奶等食品中的EC，在前處理時(shí)向樣品中加入EC-d5作為內(nèi)標(biāo)物，該方法的檢出限不超過5 ng/g，回收率在94.2%～108.3%之間。GC-MS法的靈敏度好、穩(wěn)定性和回收率高，但是檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到萃取條件如溶劑、溫度和時(shí)間的影響，同時(shí)樣品基質(zhì)和酒精含量對(duì)檢測(cè)結(jié)果也有一定的影響，對(duì)低EC含量的食品檢測(cè)差異性比較大。

2.1.3 薄層色譜法 黃秋婷等[33]建立了薄層色譜數(shù)碼成像法，將EC直接上樣至薄層板，用在磷酸創(chuàng)造的酸性環(huán)境下用肉桂醛對(duì)EC進(jìn)行衍生，得到的衍生物能夠在365 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下產(chǎn)生445～460 nm范圍內(nèi)的熒光，展開劑展開后在暗箱式紫外分析儀在365 nm下掃描薄層板，運(yùn)用MATLAB對(duì)衍生物的熒光斑點(diǎn)進(jìn)行積分定量，該方法的檢出限為59.5 μg/L，樣品加標(biāo)回收率為60.12%～84.70%。該法操作方便簡(jiǎn)單，無需前處理，但由于人工上樣不均勻且不同薄層板之間的差異較大，因此該法的穩(wěn)定性較差。

2.2 光譜法

雖然色譜技術(shù)能夠準(zhǔn)確對(duì)痕量的EC進(jìn)行定量檢測(cè)，但是由于其操作復(fù)雜、成本較高，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)?？焖俸Y查，因此，光譜技術(shù)可以作為色譜技術(shù)的補(bǔ)充，對(duì)EC進(jìn)行半定量的篩查。常用的EC光譜檢測(cè)技術(shù)主要有傅里葉變換紅外光譜、核磁共振波譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜等。

2.2.1 傅里葉變換紅外光譜 隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)以及計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，研究人員將傅里葉變換紅外光譜法運(yùn)用在食品檢測(cè)領(lǐng)域[34]。Manley等[35]運(yùn)用軟件獨(dú)立建模分類法結(jié)合FTIR，對(duì)葡萄汁和葡萄酒中EC含量進(jìn)行了大批量檢測(cè)，雖然樣品分辨率達(dá)到了80%～88%，但是樣品EC實(shí)際值和檢測(cè)值之間的相關(guān)性較差（r=0.47）。Lache Nmeier等[36]用傅立葉變換紅外光譜儀，通過偏最小二乘回歸衰減法對(duì)82個(gè)果酒樣品中的EC含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)對(duì)比GC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)FTIR檢測(cè)方法定量分析的準(zhǔn)確性較差，但由于前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速方便，該方法可以作為半定量分析用于大規(guī)模篩查。

2.2.2 核磁共振波譜 Monakhova等[37]首次將核磁共振波譜技術(shù)于偏最小二乘法（PLS）結(jié)合，對(duì)112個(gè)果酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，核磁共振波譜提供全面的結(jié)構(gòu)信息，研究者基于芳香族區(qū)域中的PLS校準(zhǔn)進(jìn)行間接定量，通過GC-MS/MS驗(yàn)證PLS模型的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EC含量小于1 mg/L時(shí)，該方法能夠提供可靠的EC定量分析，具有良好的靈敏度和選擇性。

2.2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜 表面增強(qiáng)拉曼光譜法是通過檢測(cè)樣品吸附在金、銀等粗糙表面的拉曼散射信號(hào)，從而獲得待測(cè)樣品信息的方法[38]。Yang等[39]以銀包裹的納米金粒子制備銀星納米顆粒作為信號(hào)放大器，可在樣品中提高EC的拉曼增強(qiáng)作用，選取1 003 cm-1處的特征譜帶用于EC定量，檢出限范圍為0.8～11.9 μg/L。Qi等[40]用AgNO3、抗壞血酸和聚乙烯吡咯烷酮制備了花形銀納米顆粒，將其吸移在硅片上，以785 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，選取857 cm-1處的特征譜帶建立拉曼強(qiáng)度和EC濃度之間的回歸模型，該方法的線性范圍為10-9～10-5 mol/L，在白酒樣品的檢測(cè)中，回收率為89.94%～90.14%。Du等[41]將EC吸附在Ag20團(tuán)簇上，形成絡(luò)合物C3H7NO2-Ag20，該絡(luò)合物的拉曼強(qiáng)度比EC常規(guī)拉曼強(qiáng)度增強(qiáng)了10倍左右，在化學(xué)與電磁場(chǎng)增強(qiáng)共同作用下，絡(luò)合物的表面拉曼增強(qiáng)因子達(dá)到3.6×1010，因此可以看出表面增強(qiáng)拉曼光譜法能夠?qū)C進(jìn)行痕量檢測(cè)。

2.3 其他方法

隨著快檢技術(shù)的發(fā)展，越來越多國(guó)內(nèi)外研究者致力于EC快檢方法的研究和建立，如酶法、免疫分析法以及分子印跡法等快檢方法。

2.3.1 酶法 酶分析法是利用酶的特異性這一特點(diǎn)，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定性和定量分析。劉麗斌等[42]發(fā)現(xiàn)，EC在溴水-氫氧化鈉增敏處理后，對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制效果顯著提高，并且在一定范圍內(nèi)，酶活性的抑制效果與EC的濃度線性相關(guān)，該檢測(cè)方法在1～7.5 mg/L范圍內(nèi)線性良好，檢出限為41.77 μg/L。該方法操作簡(jiǎn)單，條件溫和，檢測(cè)成本較低。LU等[43]建立谷氨酸脫氫酶/氨基甲酸酯降解酶的雙酶偶聯(lián)反應(yīng)體系，根據(jù)監(jiān)測(cè)NADH的濃度變化來實(shí)現(xiàn)對(duì)EC的定量檢測(cè)，進(jìn)而開發(fā)了基于雙酶體系的分光光度法檢測(cè)EC，在NADH在340 nm處的吸光度與EC的濃度在0.3～50 μmol/L范圍內(nèi)線性正相關(guān)，該法檢出限為9.28 nmol/L。Zhang等[44]同樣基于谷氨酸脫氫酶/氨基甲酸酯降解酶的雙酶體系，將兩種酶用殼聚糖和明膠包裹并固定在石墨電極表面，從而建立電流型生物傳感器，該傳感器的檢測(cè)范圍為0.4～50 μmol/L，檢出限為5.30 nmol/L，測(cè)定黃酒中的EC，回收率為100%～103%。這種酶分析法是基于酶的高度專一性對(duì)EC進(jìn)行定量，無需對(duì)樣品前處理，易于操作，檢測(cè)結(jié)果較為穩(wěn)定，靈敏度較高。

2.3.2 免疫分析法 免疫分析法是基于抗原和抗體的特異性識(shí)別和可逆性結(jié)合而建立的相對(duì)高效的檢測(cè)方法。馬曉馳等[45]設(shè)計(jì)并合成了一種新型EC半抗原，進(jìn)而制備抗原及抗血清，抗血清效價(jià)1∶10 000，對(duì)抗血清的免疫活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，靈敏度和特異性顯示良好。Luo等[46]將EC用9-呫噸醇衍生化后，制備其抗原和抗體，并通過間接ELISA法檢測(cè)黃酒中的EC，檢出限為166 μg/L，回收率為84.4%～100.9%。在上述研究的基礎(chǔ)上，Luo等[47]將熒光納米硅顆粒引入ELISA的OPD-H2O2底物顯色系統(tǒng)中，建立熒光-酶聯(lián)免疫吸附法，用于檢測(cè)紅酒中的EC，辣根過氧化物酶催化OPD的產(chǎn)物DAP可以有效地猝滅納米硅在440 nm處的發(fā)射的熒光信號(hào)，大大提升了ELISA的靈敏度，該方法的工作范圍為3.9～105 μg/L，檢出限為2.6 μg/ L。任勃儒[48]制備EC的抗體和抗原，用膠體金標(biāo)記EC抗體，與EC人工抗原發(fā)生特異性結(jié)合，以此制備金標(biāo)免疫層析試紙條用于檢測(cè)發(fā)酵醋，該方法的檢出限為0.5 μg/L，選擇性高，無前處理過程，檢測(cè)過程方便快捷、操作人員學(xué)習(xí)成本低。

2.3.3 分子印跡法 分子印跡聚合物是以待測(cè)分子為模板，通過分子印跡技術(shù)合成的物質(zhì)，該聚合物具有特異性識(shí)別位點(diǎn)，能夠?qū)δ０宸肿舆M(jìn)行高效的特異性識(shí)別和選擇性吸附。劉紀(jì)紅等[49]以EC作為模板分子、MMA為功能單體制備了EC分子印跡聚合物，再與CdSe/CdS核殼量子點(diǎn)結(jié)合，制備了EC熒光分子印記復(fù)合微球，使其具有較好的熒光猝滅作用，利用該微球檢測(cè)EC，檢測(cè)線性范圍為1 ～5 mmol/L。李曼麗[50]以EC為模板分子，PTMSO為功能單體制備了EC分子印跡聚合物，并建立了EC分子印跡電化學(xué)傳感器，該方法線性范圍為10-10～10-6 mol/L，檢出限為3.14 nmol/L，回收率為97.2%～108%。Wu等[51]首次將SERS、固相萃取SPE與分子印跡技術(shù)結(jié)合用于檢測(cè)黃酒中的EC，結(jié)果表明，該法在0～500 mg/L 范圍內(nèi)對(duì)黃酒中EC的含量有較好的定量能力。分子印跡法特異性強(qiáng)，可以排除樣品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，同時(shí)可以結(jié)合不同的檢測(cè)手段，以提高檢測(cè)靈敏度。

3 結(jié)論與展望

近年來，國(guó)內(nèi)外研究者開發(fā)了許多EC的檢測(cè)方法，各種方法在靈敏度、回收率、穩(wěn)定性和便捷性上各有特色，互為補(bǔ)充。對(duì)于痕量檢測(cè)而言，色譜法尤其是氣相色譜-質(zhì)譜法應(yīng)用廣泛，其準(zhǔn)確性、靈敏度和檢測(cè)的穩(wěn)定性相較于其他方法較高，但是由于前處理過程復(fù)雜、檢測(cè)成本較高，該方法無法滿足大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)篩查工作。因此，國(guó)內(nèi)外研究者開發(fā)出了諸多其他可用于大規(guī)模篩查的快速檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單、便攜度高，且對(duì)EC具有較好的選擇性，能夠達(dá)到對(duì)EC的定性和半定量檢測(cè)。

發(fā)酵食品在我國(guó)日常生活中隨處可見且種類繁多，國(guó)民對(duì)其質(zhì)量安全也十分重視。因此，針對(duì)傳統(tǒng)儀器檢測(cè)法，應(yīng)開發(fā)更加高通量、便捷快速的前處理方法，以提高檢測(cè)效率;針對(duì)快檢方法，排除基質(zhì)效應(yīng)的影響、優(yōu)化現(xiàn)有方法并建立能夠檢測(cè)不同食品基質(zhì)中EC的方法具有重要意義;同時(shí)，我國(guó)應(yīng)當(dāng)盡快出臺(tái)EC在發(fā)酵食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，以此來促進(jìn)我國(guó)發(fā)酵食品產(chǎn)業(yè)的健康和穩(wěn)定發(fā)展。

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Research Advancements on Detection Methods of Ethyl Carbamate in Fermented Food

MA Xiao-chi，JIN Nuo，LIU Jia-meng，SUN Jing，JIA Ning，SUN Yu-feng*，F(xiàn)AN Bei*

（Institute of Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/ Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety in Harvest，Storage，Transportation，Management and Control，MOA，Beijing 100193，China）

Abstract：Ethyl carbamate is widely found in fermented foods.In 2007，ethyl carbamate was classified as a Class 2A carcinogen by the International Agency for Research on Cancer of the World Health Organization.Researchers have developed detection methods suitable for different sample conditions and research purposes.This article reviewed the traditional and rapid methods for the detection of ethyl carbamate，including chromatography，spectroscopy，and other detection methods，and describes the application characteristics and detection results of these methods in fermented food.The development trend of ethyl ester detection technology is prospected.

Keywords：ethyl carbamate;fermented food;traditional detection;rapid detection

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地收貯運(yùn)質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：GJFP2019019）。

作者簡(jiǎn)介：馬曉馳（1995— ），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全。

共同通信作者：孫玉鳳（1984— ），女，博士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與品質(zhì)評(píng)價(jià);范蓓（1981— ），女，博士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全。