謝璟 鄭炎焱 徐曉敏 朱莉

皮膚光老化是指長(zhǎng)期日光中的紫外線照射皮膚后引起的皮膚老化現(xiàn)象[1]。引起光老化的紫外線主要是長(zhǎng)波紫外線（ultraviolet A，UVA），中波紫外線（ultraviolet B，UVB），其中，大部分UVB被皮膚表皮吸收，小部分UVB可到達(dá)真皮淺層，而UVA可穿透表皮直達(dá)真皮深處，并在細(xì)胞中長(zhǎng)期累積[2]。長(zhǎng)期紫外線輻射可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），由于ROS的產(chǎn)生，體內(nèi)氧化應(yīng)激通路被啟動(dòng)，進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-kappaB，NF-κB）信號(hào)通路表達(dá)，引起炎癥損傷、膠原蛋白降解，甚至誘發(fā)皮膚癌[3]。當(dāng)前，開(kāi)發(fā)具有抗氧化活性的藥物來(lái)抵抗紫外線的輻射并預(yù)防和延緩皮膚老化，已成為皮膚醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。楊梅黃酮（Myricetin，Myr）是楊梅樹(shù)中提取的黃酮類抗氧化劑，可以與金屬形成螯合物，減少金屬離子對(duì)氧化作用的催化活性、抑制氧化酶活性、減少α-生育酚自由基等方式發(fā)揮抗氧化作用。此外，Myr還具有多種生物學(xué)活性，包括抗癌、防癌、抗菌、抗病毒、抗炎等[4]。但目前，Myr對(duì)紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化保護(hù)作用及潛在機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過(guò)建立小鼠和角質(zhì)細(xì)胞光老化模型，初步探討Myr對(duì)皮膚光老化及NF-κB通路表達(dá)的抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 選取雄性健康SPF級(jí)昆明小鼠50只，體重（30±2）g，鼠齡6～8周，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，每籠10只，自由攝食攝水，動(dòng)物房室溫控制在20～25℃，濕度60%，12 h明暗周期循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人皮膚角質(zhì)形成（human keratinocytes，HaCaT）細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；紫外線照射計(jì)和SS-03AB型紫外線光療儀（UVA燈管6支≤20J/cm2；UVB燈管4支，≤5 J/cm2）購(gòu)自中國(guó)上海SIGMA高技術(shù)有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Myr購(gòu)自中國(guó)西安開(kāi)來(lái)生物技術(shù)工程有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IκB）-α和環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2抗體購(gòu)自中國(guó)Proteintech公司；MTT試劑盒和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；青霉素、鏈霉素和胰酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗氧化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)Solarbio公司；引物序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠光老化模型構(gòu)建 光老化小鼠模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)[5]：將光療儀固定于暗室頂部，照射高度為30 cm；采用嬰兒理發(fā)器剃除小鼠背部的絨毛，再用脫毛膏二次脫毛，然后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，即空白對(duì)照組（未經(jīng)紫外線照射和藥物處理）、模型對(duì)照組（背部涂抹0.9%氯化鈉溶液2 ml）、低劑量組（背部涂抹5 mg/ml Myr 2 ml）、中劑量組（背部涂抹20 mg/ml Myr 2 ml）、高劑量組（背部涂抹50 mg/ml Myr 2 ml），每組各10只；除空白對(duì)照組外，每組均隔日照射紫外線，照射前l(fā) h涂抹藥物或0.9%氯化鈉溶液，30 min后用棉簽拭去殘留藥物；照射強(qiáng)度為UVB 0.18 mW/cm2，UVA 1.25 mW/cm2，第1周至第7周每次照射時(shí)間為30 min，以后每周照射時(shí)間延長(zhǎng)10 min，12周時(shí)每次照射時(shí)間為80 min，直至14周終止（建模期間UVA照射計(jì)量累計(jì)達(dá)148.5 J/cm2，UVB照射計(jì)量累計(jì)達(dá)21.38 J/cm2）；定期觀察各組小鼠背部皮膚皺紋生成、色素沉著、皮膚角化、毛細(xì)血管擴(kuò)張等現(xiàn)象。

1.2.2 小鼠皮膚組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 小鼠末次造模實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，采用戊巴比妥鈉腹腔注射處死，取照射區(qū)部分皮膚組織，中性甲醛固定，乙醇系列脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成切片后分別進(jìn)行HE染色和膠原纖維染色。

1.2.3 HaCaT細(xì)胞光老化模型構(gòu)建 采用含10%FBS，100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2和20%O2條件下培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞。將HaCaT細(xì)胞按2.5×106個(gè)/ml接種在6孔板中，2 ml/孔，培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗細(xì)胞2次后并向每孔加入2 ml PBS，分別采用0、15、20、25、30 mJ/cm2UVB（發(fā)射峰為313 nm）處理細(xì)胞，每種劑量設(shè)8個(gè)復(fù)孔。采用MTT試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活性（操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)），確定細(xì)胞半數(shù)致死劑量。按5×104個(gè)/孔接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，分別采用含0、5、15、25、35、50μM Myr的培養(yǎng)基（分別為0、5、15、25、35、50μM Myr組）培養(yǎng)細(xì)胞24 h，每個(gè)Myr濃度組做8個(gè)復(fù)孔。用PBS清洗細(xì)胞2次后并加入1 ml PBS，采用半數(shù)致死UVB劑量處理細(xì)胞，并以未經(jīng)紫外線照射和藥物處理細(xì)胞作為對(duì)照組，檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

1.2.4 抗氧化能力檢測(cè) 去除小鼠背部照射區(qū)皮膚皮下脂肪并稱重，制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行ROS水平測(cè)定。皮膚組織抗氧化能力檢測(cè)指標(biāo)包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutasea，SOD）水平、總抗氧化力（total antioxidant capacity，T-AOC）和羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，即各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化并用1ml PBS重懸后，添加ROS細(xì)胞滲透性指示劑CM-H2DCFDA至終濃度1μM/ml，37℃暗室孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的ROS積聚情況。

1.2.5 IκBα和COX-2表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)。使用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解后，取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度；30μg蛋白上樣，經(jīng)15% SDSPAGE電泳分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h；按照磷酸化（p）-IκBα、IκBα、COX-2和βactin說(shuō)明書(shū)中建議的使用濃度，4℃過(guò)夜孵育PVDF膜；漂洗PVDF膜，加入二抗，室溫孵育1.5 h后漂洗，并進(jìn)行顯影，Quantity One軟件掃描各條帶的光密度并分析結(jié)果。

1.2.6 IκBα和COX-2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 提取細(xì)胞和組織RNA后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，qRT-PCR檢測(cè)樣本中的COX-2表達(dá)量。IκBα上游引物：5'-TGAGGACCAGCAGTGTCTTG-3'，下游引物：5'-CATCGTTGATCACAAGTCGG-3'。COX-2上游引物：5'-TAAGTGCGATTGTACCCGGAC-3'，下游引物：5'-TTTGTAGCCATAGTCAGCATTGT-3'。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射后小鼠皮膚外觀及組織形態(tài) 空白對(duì)照組小鼠背部皮膚細(xì)膩光滑，皮膚色澤正常，富有彈性；皮膚結(jié)構(gòu)、層次清晰，毛囊汗腺等完整可見(jiàn)，膠原纖維呈波浪狀緊密排列，整齊有序，分布均勻，膠原束的走向大多與皮面平行。其余各組經(jīng)紫外線照射8周后，均出現(xiàn)不同程度的皮膚粗糙增厚，紋理加深加寬，鱗屑增加，皮膚皺褶明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張現(xiàn)象。模型對(duì)照組表皮不規(guī)則增厚，伴有角化過(guò)度，真皮膠原纖維排列紊亂，膠原束散開(kāi)，彈力纖維增多、扭曲，以毛囊周圍增多較明顯；不同劑量的Myr處理后，表皮厚度不一，與模型對(duì)照組比較，真皮膠原纖維變性程度輕，排列呈現(xiàn)不同程度的紊亂，彈力纖維有所減少。其中，以中劑量組光老化反應(yīng)和組織病變程度最輕，皮膚稍粗糙增厚，表面有少許鱗屑，皮膚可見(jiàn)淺皺褶，毛細(xì)血管輕微擴(kuò)張。組織病理顯示表皮不規(guī)則增厚，伴有角化過(guò)度，真皮膠原纖維排列較紊亂，膠原束部分散開(kāi)。見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

2.2 紫外線照射后各組小鼠皮膚抗氧化能力及IκBα和COX-2 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，經(jīng)紫外線照射后，各組小鼠皮膚組織抗氧化指標(biāo)（SOD、T-AOC和HYP）及NF-κB信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)（IκBα mRNA、COX-2 mRNA）差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，低劑量組和高劑量組T-AOC活性升高，中劑量組SOD活性升高，低劑量組COX-2 mRNA表達(dá)水平降低（均P＜0.05）；與空白對(duì)照組比較，中劑量組SOD活性、T-AOC活性和HYP水平均升高，而IκBα mRNA表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。

表1 紫外線照射后各組小鼠皮膚抗氧化能力及IκBα mRNA和COX-2 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 紫外線照射后各組小鼠HaCaT細(xì)胞活性和ROS水平比較 見(jiàn)圖2。

圖2 紫外線照射后各組小鼠人角質(zhì)形成（HaCaT）細(xì)胞活性和活性氧（ROS）水平比較（a：各組小鼠HaCaT細(xì)胞活性比較；b：各組小鼠細(xì)胞內(nèi)ROS積聚水平比較；與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與0μM Myr組比較，△P＜0.05）

由圖2可見(jiàn)，隨著UVB劑量的增加，HaCaT細(xì)胞的活性逐漸降低，半數(shù)致死劑量約為20 mJ/cm2，其細(xì)胞活力為無(wú)UVB照射時(shí)的（58.60±9.07）%。在20 mJ/cm2UVB照射條件下，HaCaT細(xì)胞的活力隨著Myr處理濃度升高而上升，當(dāng)Myr濃度達(dá)到35、50μM時(shí)，細(xì)胞活性分別為對(duì)照組的（72.20±8.26）%和（85.80±4.97）%，與0μM Myr組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。UVB照射后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平均不同程度升高，但Myr可抑制ROS上調(diào)，與對(duì)照組比較，當(dāng)Myr濃度為35、50μM時(shí)，組間ROS水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 紫外線照射后各組小鼠HaCaT細(xì)胞IκBα和COX-2表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2、圖3。

由表2、圖3可見(jiàn)，經(jīng)紫外線照射后，與對(duì)照組比較，0μM Myr組p-IκBα、IκBα蛋白、IκBα mRNA、COX-2蛋白及COX-2 mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.05），50μM Myr組p-IκBα蛋白、IκBα mRNA、COX-2蛋白及COX-2 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）。

圖3 加入楊梅黃酮（Myr）紫外線照射后皮膚磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（p-IκBα）、核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白（IκBα）和環(huán)氧化酶（COX）-2蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 紫外線照射后各組小鼠HaCaT細(xì)胞IκBα和COX-2表達(dá)水平比較

3 討論

高達(dá)80%～90%的皮膚老化是由于環(huán)境和外來(lái)生物制劑（外部老化）造成的，而長(zhǎng)期紫外線照射是皮膚老化的主要原因[6-7]。紫外線照射皮膚數(shù)小時(shí)后，炎性細(xì)胞在皮膚表皮和真皮局部浸潤(rùn)，并產(chǎn)生大量的ROS。ROS細(xì)胞內(nèi)聚積可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、引起DNA突變和蛋白變性，進(jìn)而影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致功能障礙[8]。而長(zhǎng)期由ROS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)不僅會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷，還將通過(guò)DNA損傷和激活癌基因的方式促進(jìn)基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤等疾病發(fā)生[9]。尋找一種安全、高效的抗氧化劑，對(duì)于預(yù)防和延緩皮膚光老化有著重要意義。

Myr又稱3,5,7,3',4',5'-六羥基黃酮，是一種天然安全的黃酮類化合物，相較于其他同類化合物，具有更強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化活性[10-11]。現(xiàn)有的Myr研究主要集中于腫瘤[12]、神經(jīng)退行性病變[13]、心血管疾病[14]等領(lǐng)域，在皮膚光老化的防治方面研究仍較為缺乏。本文結(jié)果顯示，Myr可有效抑制紫外線對(duì)小鼠皮膚的組織學(xué)病變和膠原纖維變性，并上調(diào)膠原蛋白特征性氨基酸HYP水平。ROS在皮膚聚集將持續(xù)消耗皮膚抗氧化物質(zhì)，其中SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，其作用主要是清除超氧化物自由基，而T-AOC代表了機(jī)體清除ROS的能力[15-16]。本研究通過(guò)對(duì)不同劑量Myr處理后的皮膚組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Myr不同程度提高組織SOD和T-AOC活性。其中，相比模型對(duì)照組，20 mg/ml Myr可顯著提高小鼠皮膚抗氧化能力。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚抵抗紫外線的首要屏障，在光老化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本文通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞光老化模型也證實(shí)，Myr可有效抑制UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的殺傷作用和ROS細(xì)胞內(nèi)聚集。提示Myr可通過(guò)提高皮膚抗氧化的能力來(lái)延緩皮膚光老化。

當(dāng)細(xì)胞受到外界的刺激使其會(huì)發(fā)生反應(yīng)，首先通過(guò)細(xì)胞表面的一些受體或者蛋白將細(xì)胞外信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)，隨后細(xì)胞根據(jù)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部的信息，細(xì)胞內(nèi)部一系列的蛋白分子與生理功能被激活，稱這些蛋白分子構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)為信號(hào)通路。紫外線照射后NF-κB信號(hào)通路被激活是曬傷引起炎癥反應(yīng)的第一步。COX-2是NF-κB的一個(gè)下游靶點(diǎn)，因此，筆者推測(cè)Myr可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制紫外線輻射對(duì)人角質(zhì)細(xì)胞的損傷作用。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究將HaCaT細(xì)胞用20 mJ/cm2紫外線照射，然后用Myr處理細(xì)胞，之后收集細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞p-IκBα和IκBα蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫外線照射后細(xì)胞內(nèi)的p-IκBα水平表達(dá)顯著上調(diào)，IκBα未產(chǎn)生明顯變化，當(dāng)采用50μM的Myr處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p-IκBα表達(dá)被抑制，IκBα仍未產(chǎn)生顯著的變化。因此，筆者得出結(jié)論Myr可能是通過(guò)NF-κB信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制紫外線照射對(duì)細(xì)胞的損傷作用。多種信號(hào)通路都可通過(guò)降解IκBα的方式活化NF-κB，主要是使IκBα的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化?；罨蟮腘F-κB可以入核與DNA結(jié)合發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。IκBα首先是在IκBα激酶的作用下發(fā)生絲氨酸殘基磷酸化，接下來(lái)IκBα在E3泛素化酶復(fù)合體催化下進(jìn)行泛素化而被蛋白酶降解?；罨蟮腘FκB參與機(jī)體多種調(diào)控機(jī)制，主要是發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性功能，誘導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路主要由p50/p65介導(dǎo)，在未激活狀態(tài)下，p50/p65與抑制因子IκBα結(jié)合形成蛋白復(fù)合體存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)鞍讖?fù)合體受ROS、TNF、IL-1等刺激，將引起IκBα磷酸化并與p50/p65解離，進(jìn)一步誘導(dǎo)p50/p65入核，啟動(dòng)下游炎癥相關(guān)蛋白COX-2的表達(dá)[17-18]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)Myr對(duì)小鼠和細(xì)胞IκBα和COX-2的作用表明，Myr可有效抑制紫外線對(duì)皮膚組織和細(xì)胞的IκBα和COX-2的上調(diào)作用，下調(diào)IκBα磷酸化水平，提示Myr可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制紫外線照射的損傷作用。

綜上所述，本研究通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Myr可提高皮膚抗氧化能力，通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性，具有抑制紫外線誘導(dǎo)的皮膚光老化作用。