華湯鋒 金紅芳 呂晨 郭小文

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接損傷和功能紊亂所引起，并由傷害性感受通路活動(dòng)異常導(dǎo)致的一種慢性疼痛，是臨床亟待解決的常見病、難治病，而痛覺敏化是其特征性表現(xiàn)。既往研究提示，神經(jīng)組織慢性炎癥、神經(jīng)元凋亡和表觀遺傳學(xué)改變，可能在其發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[1-2]。木犀草素（3,4,5,7－四羥基黃酮）是一種天然黃酮類物質(zhì)，存在于多種植物性食物和中草藥中，有研究表明其具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)功能[3-4]。在對其抗傷害性感受作用的研究中發(fā)現(xiàn)，木犀草素可顯著提高急性疼痛和化學(xué)刺激引發(fā)的痛閾水平，相關(guān)研究報(bào)道還證實(shí)其對慢性疼痛也有改善作用[5-7]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1，sirt1）具有調(diào)控機(jī)體細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等作用，其與叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）組成的sirt1/FOXO1信號通路可抑制炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，在神經(jīng)、血管等組織退行性改變的病理過程中，起著重要的調(diào)控作用[8]，而黃酮類物質(zhì)在多項(xiàng)研究中表現(xiàn)出潛在活化sirt1/FOXO1信號通路的作用[3，9]?；诖耍狙芯客ㄟ^慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠痛覺敏化模型，探討木犀草素調(diào)控sirt1/FOXO1通路對CCI大鼠慢性NP所致痛覺敏化的影響，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠72只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（滬）2018-0016，體重240～260 g，喂飼普通飼料，自由飲水進(jìn)食，自然節(jié)律采光。木犀草素粉劑（T1027）購自美國Target－Mol公司（純度＞98%）；兔源GAPDH一抗（ab181602）、兔源sirt1一抗（ab189494）、兔源FOXO1一抗（ab39670）、羊抗兔二抗（ab150077）均購自美國Abcam公司，乙?；疐OXO1一抗（CST9441）購自美國Cell signaling technology公司；sirt1抑制劑EX527粉劑（S1541）購自美國Selleck公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8418）購自美國Sigma公司；圖片灰度值分析及凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc）為美國BioRad公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術(shù)組（S組）、坐骨神經(jīng)結(jié)扎組（CCI組）、CCI聯(lián)合木犀草素腹腔給藥組（Lut組）、CCI聯(lián)合木犀草素和EX527腹腔給藥組（Lut+EX組），每組各18只。

1.2.2 CCI模型建立 CCI組、Lut組和Lut+EX組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg進(jìn)行麻醉，消毒大鼠左下肢，切開左側(cè)大腿中部暴露坐骨神經(jīng)，在接近其分叉之前游離出約7 mm的神經(jīng)，用4根320鉻制羊腸線間隔1 mm進(jìn)行松結(jié)扎，要求不阻斷神經(jīng)血供，然后逐層縫合切口。S組僅暴露坐骨神經(jīng)并游離連接組織，但不做CCI。

1.2.3 腹腔給藥 將木犀草素粉劑100 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成50 mg/ml濃度混懸液備用，EX527粉劑20 mg溶于含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2 ml中配制成10 mg/ml濃度混懸液備用。模型建立后，S組和CCI組腹腔注射含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液2.5 ml/kg；Lut組腹腔注射木犀草素混懸液（木犀草素劑量為100 mg/kg）2.0 ml/kg+含1%DMSO的0.9%氯化鈉注射液0.5 ml/kg；Lut+EX組腹腔注射木犀草素混懸液（木犀草素劑量為100 mg/kg）2.0 ml/kg＋EX527混懸液（EX527劑量為5 mg/kg）0.5 ml/kg。各組大鼠均連續(xù)給藥7 d。

1.3 疼痛敏化行為學(xué)檢測 分別于CCI前1天及CCI后第1、3、7、14天檢測各組大鼠機(jī)械性縮足反射閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）。

1.3.1 MWT檢測 采用Von Frey細(xì)絲方法。機(jī)械測痛儀放置水平桌面，將大鼠放于儀器的有機(jī)玻璃箱中，待15min后適應(yīng)環(huán)境。分別采用不同折力的Von Frey細(xì)絲刺激大鼠的足底部，觀察縮足反應(yīng)情況，當(dāng)折力達(dá)到一定閾值時(shí)，足底移開Von Frey細(xì)絲而出現(xiàn)快速的縮足反應(yīng)，將此折力記錄為MWT，每次測量間隔2min，測量3次取平均值。

1.3.2 TWL檢測 采用熱輻射法。取輻射熱痛覺測試儀的聚光光源照射大鼠足底部，觀察和記錄由照射到出現(xiàn)縮足的時(shí)間作為TWL，最大閾值為25 s，測量3次取平均值。

1.4 脊髓背角標(biāo)本采集、保存、組織裂解 各組大鼠于CCI前1天和CCI后第7、14天行為學(xué)測定結(jié)束后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分別選取6只大鼠注射過量烏拉坦處死，分離左側(cè)（CCI同側(cè)）L4～5段脊髓組織，迅速置于液氮中保存。測定前加入蛋白裂解液充分裂解，用Bradford法測定蛋白質(zhì)的濃度并調(diào)整為2μg/μl。

1.5 脊髓背角中sirt1、FOXO1、乙?；疐OXO1蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。SDS-PAGE蛋白電泳，硝酸纖維素膜-電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)印蛋白，TBS封閉后將硝酸纖維素膜與抗單克隆一抗（1∶1 000），辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶6 000，Abcam）進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)。以GAPDH（1∶1 000）為參照，加入的底物DAB H2O2溶液顯色。采用BioRad圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理和蛋白表達(dá)水平測定。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠MWT的比較 CCI前1天各組大鼠MWT相近（P＞0.05）；CCI后第1、3、7、14天，CCI組、Lut組、Lut+EX組MWT均低于S組（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut組MWT明顯高于CCI組（均P＜0.05），而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠M W T的比較（s）

2.2 各組大鼠TWL的比較 CCI前1天各組大鼠TWL相近（P＞0.05）；CCI后第1、3天，CCI組、Lut組、Lut+EX組TWL均低于S組（均P＜0.05），第7、14天時(shí)Lut組與S組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而另兩組明顯低于S組（均P＜0.05）；CCI后第1、3、7、14天，Lut組TWL均明顯高于CCI組（均P＜0.05），而Lut+EX組與CCI組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠T WL的比較（s）

2.3 各組大鼠脊髓背角sirt1、FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白水平的比較 與S組比較，各組大鼠CCI后第7、14天脊髓背角sirt1蛋白水平均下降（均P＜0.05），Lut組和Lut+EX組sirt1蛋白水平較CCI組均明顯增高（均P＜0.05）。與S組相比，各組大鼠在CCI后第7、14天脊髓背角FOXO1和乙?；疐OXO1蛋白水平均上調(diào)（均P＜0.05）；與CCI組和Lut+EX組比較，Lut組在CCI后第7天FOXO1蛋白水平升高，第14天FOXO1蛋白水平降低，乙酰化FOXO1水平較前兩組降低更明顯（均P＜0.05）。見表3、4和圖1。

圖1 各組大鼠脊髓背角FOXO1和乙酰化FOXO1蛋白表達(dá)電泳圖[沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirt1），叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FOXO1），坐骨神經(jīng)結(jié)扎（CCI）]

表3 各組大鼠脊髓sirt1蛋白水平的比較（sirt1/GAPDH灰度值）

3 討論

NP是一種復(fù)雜的慢性疼痛，流行病學(xué)研究顯示，人群總體患病率高達(dá)3.0%～8.0%[1，10]，據(jù)此推算，我國有7 000萬左右患者，導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，醫(yī)療資源負(fù)擔(dān)增加。因其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，故其治療效果和預(yù)后仍亟待提高。

CCI大鼠模型是一種經(jīng)典的慢性疼痛模型，其主要機(jī)制為外周損傷和嚴(yán)重炎癥反應(yīng)誘發(fā)的神經(jīng)病理性改變，可表現(xiàn)出自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛和痛覺過敏等，與臨床病理性疼痛特征十分相似。本研究參照Bennett等[11]方法建立CCI模型，因?yàn)榇朔N方法非常類似臨床脊神經(jīng)根卡壓炎癥引發(fā)的NP，且操作創(chuàng)傷較小，不給予其它神經(jīng)毒性藥物，因此建模過程中，實(shí)驗(yàn)大鼠均存活至研究結(jié)束。CCI大鼠建模后第1～14天，MWT和TWL均明顯低于S組，同時(shí)說明CCI模型構(gòu)建成功。

木犀草素作為一種天然黃酮類物質(zhì)，存在于多種蔬菜、水果和藥用植物中，并且具有各種藥理活性。而具有鎮(zhèn)痛藥效的中草藥如川穹、紫菀等均含有此類黃酮物質(zhì)[3-4]。在多項(xiàng)動(dòng)物研究中證實(shí)，木犀草素可以改善NP。不同的給藥方式（椎管內(nèi)和顱內(nèi)給藥）呈現(xiàn)不同的下游受體活化，包括GABA受體、阿片μ受體等，而且提示木犀草素抗傷害性疼痛和抗炎效能均很高，且呈劑量相關(guān)性[12]。本研究采用腹腔注射給藥，其優(yōu)點(diǎn)是腹膜面積大、血管和淋巴管分布豐富，吸收能力強(qiáng)；另一方面，木犀草素水溶性低，溶媒采用1%DMSO，而腹腔給藥，可降低其毒性反應(yīng)。本研究結(jié)果同樣顯示，Lut組大鼠CCI后各個(gè)時(shí)點(diǎn)的MWT和TWL均顯著高于CCI組大鼠，而在CCI后第14天，MWT和TWL已接近S組。

行為學(xué)多項(xiàng)研究已證實(shí)木犀草素可有效改善NP程度，但對其機(jī)制的研究，則多集中在抗氧化和抗炎反應(yīng)的下游蛋白和分子，如NF-κB、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMD-9）、趨化因子（CXCL2、CXCL9）等[13-14]，而對調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的信號通路和表觀遺傳學(xué)調(diào)控，如乙酰化、泛素化的上游分子機(jī)制的研究尚不足。FOXO1是O-box子家族中叉頭轉(zhuǎn)錄因子的成員，其余還包括FOXO3、O4、O6等，它在炎癥、代謝、腫瘤、缺血再灌注等多種生理病理調(diào)解中，起著重要作用[8，15]。Oscar等[16]在對高齡小鼠椎間盤退行性變引發(fā)的后背痛的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加FOXO1表達(dá)下降，其下游靶點(diǎn)sestrin 3（SESN3）和超氧化物歧化酶表達(dá)水平也隨之降低。Chen等[17]采用生物信息學(xué)和微陣列芯片技術(shù)對神經(jīng)痛大鼠的脊髓背角進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FOXO家族基因的mRNA表達(dá)增加在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)中承擔(dān)關(guān)鍵的角色。本研究發(fā)現(xiàn)CCI后，脊髓背角FOXO1蛋白表達(dá)顯著增高，尤其乙?；疐OXO1表達(dá)上調(diào)更為明顯，這必然誘導(dǎo)其下游參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的蛋白和介質(zhì)上調(diào)，而Lut組乙?；疐OXO1上調(diào)程度顯著降低，提示木犀草素可調(diào)控FOXO1的表達(dá)和乙酰化水平。

表4 各組大鼠脊髓FOXO1和乙?；疐OXO1蛋白水平的比較

FOXO1活性受乙酰化、磷酸化和泛素化調(diào)節(jié)，其中sirt1介導(dǎo)FOXO1脫乙?；饔煤?，F(xiàn)OXO1由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，并降低其生物學(xué)活性[18]。而大鼠sirt1基因啟動(dòng)子區(qū)域含有一個(gè)擬叉頭樣（forkhead-like，F(xiàn)KHD-L）結(jié)合位點(diǎn)，它與FKHD共有元件（TTGTTTAC）在8個(gè)堿基中的5個(gè)基序上反向排列，并且一組5個(gè)胰島素響應(yīng)性核心重復(fù)基序，F(xiàn)OXO1通過與這些結(jié)合元件的結(jié)合直接激活sirt1轉(zhuǎn)錄，從而形成sirt1的自反饋通路[19]。sirt1/FOXO1信號通路是能量代謝和基因組穩(wěn)定的關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路。本研究提示，在CCI組中，可以觀察到術(shù)后各時(shí)點(diǎn)脊髓背角組織中sirt1表達(dá)均下調(diào)，而乙?；疐OXO1的表達(dá)反向增高；而在Lut組中sirt1表達(dá)下調(diào)較少，同樣乙?；疐OXO1表達(dá)反向上調(diào)亦不顯。在EX527特異性拮抗sirt1效應(yīng)后，F(xiàn)OXO1和乙?；疐OXO1表達(dá)再次出現(xiàn)顯著增加。由此證實(shí)，木犀草素可以部分逆轉(zhuǎn)CCI導(dǎo)致的脊髓背角sirt1和FOXO1表達(dá)和乙酰化程度，進(jìn)而調(diào)控sirt1/FOXO1信號通路。

綜上所述，腹腔注射木犀草素能抑制CCI大鼠的機(jī)械痛敏和熱痛敏，通過增加脊髓sirt1表達(dá)并抑制FOXO1的乙酰化水平，調(diào)控sirt1/FOXO1信號通路，進(jìn)而抑制下游炎癥、疼痛相關(guān)的基因表達(dá)，最終改善CCI大鼠的痛覺敏化。但木犀草素的藥理作用尚未完全清楚，在NP中的作用可能存在更為廣泛的分子靶點(diǎn)，長期使用是否存在神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥，這些仍需進(jìn)一步的研究探討。