晏峰 鐘益芳 任振喚 戴數(shù) 周穎 胡云良

有研究發(fā)現(xiàn)，我國高血壓人群的同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平明顯增高，這類合并高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）的原發(fā)性高血壓被稱為H型高血壓[1]。有研究分析高血壓患者基線Hcy水平后發(fā)現(xiàn)，以Hcy≥10μmol/L作為標(biāo)準(zhǔn)，伴有HHcy的高血壓（即H型高血壓）患者比例高達(dá)75%～80%[2-3]。相關(guān)研究證實(shí)H型高血壓也是發(fā)生腦卒中的重要原因之一，可使患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險比達(dá)11.3，是健康人群的25～30倍[4]，因此認(rèn)為高血壓和HHcy對腦卒中的發(fā)生可能具有協(xié)同作用。另有研究顯示L型鈣離子調(diào)節(jié)通道與原發(fā)性高血壓的形成密切相關(guān)，鈣離子通道a1c亞基是形成L型鈣離子通道的中心孔蛋白，L型鈣通道亞基基因CACNA1C突變易導(dǎo)致鈣離子通道主要功能喪失，這種功能喪失可能導(dǎo)致高血壓的發(fā)生[5-7]，Beitelshees等[8]認(rèn)為基因CACNA1C多態(tài)性與血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力變化有關(guān)，影響動脈粥樣斑塊的生成以及高血壓、腦卒中的發(fā)生。Yokoyama等[9]認(rèn)為CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位點(diǎn)多態(tài)性對血管痙攣、內(nèi)皮細(xì)胞功能有影響。因此，本研究通過測定CACNA1C的rs2299661、rs216008、rs1051375、rs10848683和rs215976位點(diǎn)的多態(tài)性，探討H型高血壓患者腦卒中的危險因素及CACNA1C基因多態(tài)性與Hcy之間的關(guān)系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年11月至2019年1月麗水市人民醫(yī)院收治的高血壓患者1 096例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中國高血壓防治指南（2018修訂版）[10]；（2）HHcy符合《中國高血壓指防治南2018》中規(guī)定Hcy≥15μmol/L，或正在接受降低Hcy治療患者；（3）簽署患者知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）3個月內(nèi)發(fā)生過急性心腦血管事件；（2）確診繼發(fā)性高血壓；（3）有嚴(yán)重精神障礙，無法表達(dá)意愿；（4）出現(xiàn)其他明顯異常體征、臨床疾病和實(shí)驗室檢查結(jié)果，不適合參加研究。根據(jù)血清Hcy水平分為H型高血壓組823例（血清Hcy水平≥15μmol/L）和單純高血壓組273例。其中H型高血壓組男486例，女337例，平均年齡（65.12±11.53）歲；單純高血壓組男174例，女99例，平均年齡（62.52±9.42）歲。H型高血壓患者根據(jù)是否合并發(fā)生腦卒中分為H型高血壓腦卒中組（簡稱腦卒中組）112例和H型高血壓非腦卒中組（簡稱非腦卒中組）711例，腦卒中組男64例，女48例，平均年齡（66.87±10.22）歲，非腦卒中組男422例，女289例，平均年齡（64.52±11.14）歲。腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]：（1）急性發(fā)病的局灶性神經(jīng)功能缺失，少數(shù)可為全面性神經(jīng)功能缺失；（2）頭顱CT/MRI檢查證實(shí)腦部相應(yīng)梗死灶，或癥狀、體征持續(xù)24 h以上，或在24 h內(nèi)死亡。選擇2019年3至6月本院健康體檢者355例作為對照組，男219例，女136例；平均年齡（61.78±9.88）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）未服藥情況下收縮壓＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg；（2）排除有心腦血管病或心腦血管病史者以及有腦卒中家族史者。各組對象性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意。

1.2 方法 采用問卷調(diào)查方式記錄各組對象的性別、年齡、收縮壓、舒張壓、糖尿病、血脂異常、短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管疾病家族史、BMI等臨床資料。

1.3 觀察指標(biāo) 采集所有對象的空腹外周血6 ml，其中2 ml加入EDTAK2抗凝管中，于-70℃冰箱冷凍保存，準(zhǔn)備抽提DNA。其余4 ml用于測定血脂、TC、TG、HDL-C、LDL-C、脂蛋白（a）[Lp（a）]、Hcy、FPG等水平。H型高血壓組患者根據(jù)Hcy水平分為A組608例（Hcy＜20μmol/L），B組147例（Hcy 20～30μmol/L），C組48例（Hcy＞30μmol/L）。

1.4 DNA的提取及分型

1.4.1 DNA的制備 采用細(xì)胞裂解和血紅素/蛋白沉淀技術(shù)，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法提取基因組DNA。

1.4.2 PCR引物合成 PCR引物由SEQUENOM公司軟件Assay Design Design 3.1設(shè)計，由北京擎科公司合成，見表1。

表1 5個SN P位點(diǎn)的P CR引物及延伸引物

1.4.3 PCR擴(kuò)增及單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)分型 采用多重PCR技術(shù)對目的序列進(jìn)行擴(kuò)增，完成所選SNP位點(diǎn)基因序列的擴(kuò)增。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物中加入ddNTP，并通過延伸引物（約20 bp）只能延伸一個堿基的特點(diǎn)，來實(shí)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增。延伸結(jié)束后，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）基因分型技術(shù)，進(jìn)行SNP位點(diǎn)分型。

2 結(jié)果

2.1 各組對象臨床資料的比較 高血壓各組與對照組比較，在收縮壓、舒張壓、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、BMI的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），而TIA、房顫、心腦血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；非腦卒中組及腦卒中組與單純高血壓組比較，TIA、房顫、血清Hcy、Lp（a）水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；腦卒中組TIA、心腦血管病家族史、血清Hcy、Lp（a）均高于非腦卒中組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組對象臨床資料的比較

2.2 H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的危險因素分析 以H型高血壓患者是否出現(xiàn)腦卒中為因變量，以性別、年齡、收縮壓、舒張壓、吸煙、BMI、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Lp（a）、TIA、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管疾病家族史及Hcy為自變量，多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示：年齡、收縮壓、TIA、房顫、心腦血管病家族史、Lp（a）及血清Hcy水平是H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的獨(dú)立危險因素，見表3。

表3 H型高血壓患者發(fā)生腦卒中的危險因素分析

2.3 血清Hcy水平與腦卒中患病率的關(guān)系 H型高血壓各組隨著患者血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表4。血清Hcy水平與腦卒中患病率呈正相關(guān)（r=0.171，P＜0.01）。

表4 不同血清Hcy水平3組H型高血壓患者腦卒中患病率的比較（例）

2.4 CACNA1C基因多態(tài)性分析 高血壓各組和對照組CACNA1C 5個SNP位點(diǎn)基因型分布經(jīng)χ2檢驗，均P＞0.05，符合Hardy-Weinberg平衡，表明4組患者具有群體代表性。

2.4.1 CACNA1C 5個SNP位點(diǎn)基因型峰圖 見圖1-5（峰的部位為多態(tài)性位點(diǎn)，單峰表示純合子，雙峰表示雜合子）。

圖1 r s215976分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

圖2 r s1051375分型3種基因型峰圖（a：A/A型；b：G/A型；c：G/G型）

圖3 r s2299661分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/G型；c：G/G型）

圖4 r s1084683分型后3種基因型峰圖（a：C/C型；b：C/T型；c：T/T型）

圖5 r s216008分型后3種基因型峰圖（a：T/T型；b：C/T型；c：C/C型）

2.4.2 各組對象CACNA1C的不同位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率的比較 高血壓各組CACNA1C的rs2299661位點(diǎn)的基因型CC頻率均高于對照組（均P＜0.05），腦卒中組與單純高血壓組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腦卒中組CACNA1C的rs2299661位點(diǎn)的C等位基因頻率高于非腦卒中組、單純高血壓組及對照組（均P＜0.05）；非腦卒中組、單純高血壓組及對照組兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976各SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表5、6。

表5 各組對象CACNA1C的不同位點(diǎn)基因型分布頻率的比較[例（%）]

表6 各組對象CACNA1C的不同位點(diǎn)等位基因頻率的比較[例（%）]

2.4.3 rs2299661 C/G不同基因型（CC型、CG型、GG型）攜帶者臨床資料的比較 rs2299661 C/G 3種不同基因型攜帶者之間的年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、TIA、房顫、飲酒、吸煙、缺乏鍛煉、心腦血管病家族史、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），而Lp（a）和Hcy水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。兩兩比較顯示CC型和CG型患者的Lp（a）和Hcy水平明顯高于GG型患者（均P＜0.05），見表7。對腦卒中組患者的rs2299661C等位基因攜帶者（CC+CG基因型）與非攜帶者（GG純合子）的生化參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩組血清Lp（a）和Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，C等位基因攜帶者的血清Lp（a）和Hcy水平均明顯高于非攜帶者（均P＜0.05），而年齡、收縮壓、舒張壓、BMI、FBG、TC、TG、HDL-C和LDL-C兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表8。

表7 3種r s2299661C/G不同基因型攜帶者臨床資料的比較

表8 腦卒中組2種r s2299661C/G不同基因型攜帶者臨床資料的比較

3 討論

目前已知的腦卒中危險因素中高血壓為腦卒中首要且獨(dú)立的危險因素，且收縮壓每增加10 mmHg，腦卒中發(fā)病相對危險增加49%；舒張壓每增加5 mmHg，腦卒中危險增加46%[12]，提示兩者可能擁有共同的遺傳易感基因。我國高血壓人群呈高Hcy水平狀態(tài)，H型高血壓約占我國成人高血壓的80%[2-3]。研究顯示中老年人血清Hcy水平與收縮壓、舒張壓或脈壓相關(guān)。隨著年齡的增長，脈壓水平和主要終點(diǎn)心血管事件之間呈正相關(guān)[19]。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)血清Hcy水平每升高5μmol/L，腦卒中風(fēng)險將升高59%，缺血性心臟病的風(fēng)險將增加32%，Hcy每降低3μmol/L，腦卒中風(fēng)險將下降24%，缺血性心臟病的風(fēng)險將會降低16%。本研究證實(shí)：高血壓患者隨著血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢。有研究顯示，在無腦卒中和心肌梗死的中國成人H型高血壓人群中，降壓和降低Hcy水平可顯著降低首發(fā)腦卒中的風(fēng)險，而對于低葉酸水平的高血壓人群，補(bǔ)充葉酸可顯著降低腦卒中發(fā)生的風(fēng)險[15]。本研究亦顯示H型高血壓組隨著患者血清Hcy水平升高，腦卒中患病率呈增高趨勢，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清Hcy水平與腦卒中患病率呈正相關(guān)（r=0.171，P＜0.01），因此認(rèn)為Hcy水平升高與腦卒中的發(fā)生存在著密切的聯(lián)系[16]。

近年來有關(guān)腦卒中候選基因研究較多集中于與血壓調(diào)節(jié)和高血壓有關(guān)的基因。電壓依賴性鈣離子通道L-VDCC[Ca（V）1]為鈣離子通道電壓依賴性鈣通道（voltage dependent Calcium channel，VDCC）的一種類型，為調(diào)控鈣離子內(nèi)流的離子通道，是目前已知選擇性最強(qiáng)的離子通道[17]。研究認(rèn)為L型鈣離子通道及其相關(guān)的多種病理生理現(xiàn)象與高血壓產(chǎn)生有密切聯(lián)系[18]，而研究證實(shí)L型鈣離子通道α1c亞單位是調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要通道，因此對人類編碼LTCCα1C亞基的基因CACNA1C研究[19]，對高血壓及腦卒中的防治有著重要的理論和臨床意義。CACNA1C基因位于染色體12p13.3，生成大約6.45 Mb的基因組區(qū)段，該基因由至少55個外顯子組成[20]。本研究對CACNA1C基因選取5個SNP（rs216008、rs1051375、rs2299661、rs10848683、rs215976）位點(diǎn)進(jìn)行測序，包括內(nèi)含子的61765C/G（rs2299661）、外顯子的558674 C/T（rs216008)、外顯子的628667 C/G（rs10848683）、外顯子的626417 A/G（rs1051375）、外顯子的532175 C/T（rs215976），分析其對H型高血壓和腦卒中的意義。研究結(jié)果顯示H型高血壓各組CACNA1C基因rs2299661位點(diǎn)基因型CC頻率均高于對照組（均P＜0.05），腦卒中組與單純高血壓組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但腦卒中組C等位基因頻率高于非腦卒中組、單純高血壓組及對照組（均P＜0.05）。筆者推斷：（1）腦卒中組與高血壓組之間可能存在著共同的遺傳易感基因；（2）CACNA1C的rs2299661C/G多態(tài)性與中國人群H型高血壓腦卒中的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。分析推測這種作用機(jī)制為：（1）內(nèi)含子的rs2299661在腦卒中組C/G可能產(chǎn)生基因變異，對鈣通道蛋白mRNA剪接產(chǎn)生影響，進(jìn)而出現(xiàn)原有的剪接位點(diǎn)消失，新的剪接位點(diǎn)生成；（2）編碼鈣通道氨基酸序列改變，這種改變可能引起鈣離子通道蛋白相關(guān)元件的變化，引發(fā)鈣離子通道通透性變化；（3）鈣離子內(nèi)流增加，肌細(xì)胞表面的動作電位改變，引起肌細(xì)胞的興奮收縮藕聯(lián)加強(qiáng)，外周血管阻力增加，出現(xiàn)腦血管的持續(xù)痙攣。另發(fā)現(xiàn)rs216008、rs1051375、rs10848683、rs215976 SNP位點(diǎn)在H型高血壓組、單純高血壓組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），說明所選其他CACNA1C基因SNP位點(diǎn)與H型高血壓或腦卒中間并無關(guān)聯(lián)性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血壓組CACNA1C基因的rs229966位點(diǎn)CG+CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯高于對照組，推測高血壓患者G位點(diǎn)基因剪接為C位點(diǎn)基因，C等位基因增多，G→C替代后，合成表達(dá)Lp（a）與Hcy的轉(zhuǎn)錄因子活性增強(qiáng)，可能促使Lp（a）與Hcy血清水平表達(dá)增加，而兩者水平的表達(dá)升高可造成動脈粥樣硬化斑塊的形成、遷移、崩解、破碎，引發(fā)腦卒中發(fā)生，進(jìn)一步引起腦卒中后繼發(fā)性腦損傷、神經(jīng)元凋亡等[21]，參數(shù)比較結(jié)果也顯示兩組Lp（a）和Hcy水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，C等位基因攜帶者的Lp（a）和Hcy水平明顯高于非攜帶者（P＜0.05），因此也證實(shí)高水平Lp（a）與Hcy與腦卒中發(fā)生呈正相關(guān)[22]，因此提示CACNA1C基因rs2299661位點(diǎn)C/G多態(tài)性可能與H型高血壓腦卒中發(fā)生有關(guān)聯(lián)，但Lp（a）與Hcy間如何相互作用，對H型高血壓腦卒中的影響仍需繼續(xù)研究。

綜上所述，腦卒中是多基因、多因素疾病，是遺傳和環(huán)境因素互相作用所致，本研究亦證實(shí)Hcy水平升高與腦卒中的發(fā)生存在著密切聯(lián)系，CACNA1C基因rs2299661位點(diǎn)C/G多態(tài)性可能與H型高血壓腦卒中發(fā)生有關(guān)聯(lián)，C等位基因可能為H型高血壓腦卒中的易感位點(diǎn)。