姚 錚，李子涵，高利明，胡 星，陳 顏，潘文琦，李 謙

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京210009）

隨著腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤免疫治療已成為近年來腫瘤治療領(lǐng)域的新途徑［1］。表達抗原特異性的嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的基因工程T細胞的過繼轉(zhuǎn)移（一種新型腫瘤免疫療法），在治療一些人類血液惡性腫瘤包括白血病和淋巴瘤方面已經(jīng)取得顯著成功［2］。單鏈可變抗原（single chain variable frag‐ment，scFv）和信號結(jié)構(gòu)域的整合能夠賦予CAR具有顯著的特異性和細胞毒性，能夠以不依賴人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的方式發(fā)揮活性。最初的CAR結(jié)構(gòu)包含scFv和CD3ζ信號結(jié)構(gòu)域，這使得T細胞具有短暫的激活和細胞毒性［3］。在一些研究和臨床試驗中，為了改善CAR-T細胞的細胞毒性和持久性，已經(jīng)將共刺激信號分子，如CD28或CD137（4-1BB）整合到細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域中［4］。

在治療血液瘤方面，特別是在急性淋巴細胞白血病中，CAR-T細胞免疫療法盡管有很高的臨床響應(yīng)率，但CAR-T細胞的過繼轉(zhuǎn)移對實體瘤的治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。從理論上講，修飾的T細胞對腫瘤部位的歸巢能力差，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）含有許多免疫抑制性細胞和其他免疫抑制因子（結(jié)構(gòu)如圖1所示）都會降低CAR-T細胞的細胞毒性。本文全面分析限制CART細胞治療實體瘤的因素，介紹一些克服這些障礙的方法，對研究人員和醫(yī)護人員有效對抗實體瘤具有一定的參考價值。

1 實體瘤腫瘤微環(huán)境中的障礙

1.1 物理屏障

TME中的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），包括蛋白聚酶和糖肽酶，對腫瘤的生物學(xué)行為和免疫系統(tǒng)的重塑有多重作用。一些研究表明，ECM中的一些蛋白質(zhì)是非結(jié)構(gòu)基質(zhì)蛋白，如硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），它們在維持腫瘤細胞增殖和遷移中起主要作用［5］。腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤基質(zhì)的主要成分。CAFs主要分布于血管周圍或腫瘤外周纖維間質(zhì)內(nèi)，分泌細胞因子、ECM以及相關(guān)酶分子。腫瘤細胞與基質(zhì)成分之間相互作用，形成了功能復(fù)雜的TME。T細胞在攻擊基質(zhì)豐富的實體瘤時幾乎沒有能力穿透腫瘤病灶部位，導(dǎo)致抗腫瘤活性的下降［6］。因此，提高工程化T細胞特異性降解富含基質(zhì)的實體瘤中ECM而又不損害其細胞毒性，將顯著增強抗腫瘤活性。

1.2 免疫抑制細胞和分泌的細胞因子

在TME中，免疫抑制主要由免疫抑制細胞介導(dǎo)：調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells，Tregs），會減弱效應(yīng)T細胞活性，促進TME的免疫抑制；骨髓源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs），作為TME中的免疫負調(diào)控因素，能夠抑制多種免疫細胞活性；M2型巨噬細胞，通過分泌輔助T細胞2（T helper 2，Th2）細胞因子促進血管生成和腫瘤侵襲。這些細胞在實體瘤內(nèi)釋放細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子β（teansforming growth factor-β，TGF-β）和白細胞介素10（IL-10），這些組成與成分都將嚴重抑制回輸?shù)腃AR-T細胞療效。

1.2.1 Tregs Tregs在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，包括CD4+CD25+Tregs和Ⅰ型Tregs，生成與作用機制如圖2所示。TGF-β對CD4+CD25+Tregs發(fā)揮功能至關(guān)重要，而Foxp3（叉頭框蛋白P3）是其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在Tregs中高表達［7］。Ⅰ型Tregs通過分泌細胞因子IL-10發(fā)揮抑制活性。一般來說，Tregs在炎癥和腫瘤部位富集，通過各種機制調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)?；罨腡regs可以通過快速吸收IL-2直接消除過多的T細胞，這導(dǎo)致缺乏足夠的效應(yīng)細胞抵抗惡性腫瘤。此外，這些抑制性細胞可以產(chǎn)生許多抑制T細胞活性的免疫調(diào)節(jié)因子，如TGF-β和IL-10，以此構(gòu)成負調(diào)節(jié)循環(huán)，形成免疫抑制。

圖2 Tregs生成與作用機制

1.2.2 MDSCs MDSCs是免疫抑制細胞的一個主要成分，負調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而降低免疫系統(tǒng)的腫瘤免疫能力。MDSCs的負調(diào)控機制是通過誘導(dǎo)型一氧化氮酶、精氨酸酶催化酶Ⅰ、環(huán)氧合酶-2、前列腺素E2、TGF-β、IL-10和Tregs介導(dǎo)其抑制作用。另外，MDSCs的存在與腫瘤細胞的生長有關(guān)，在前列腺癌和結(jié)腸癌中，MDSCs產(chǎn)生活性氮，致使趨化因子CCL2（C-C chemokine ligand2，CCL2）發(fā)生硝化，抑制Th1（T helper 1，輔助T細胞1）型效應(yīng)細胞的浸潤。因此，抑制MDSCs功能已被證實可以改善TME中的抗腫瘤免疫反應(yīng)［8］。靶向治療MDSCs的免疫檢查點c-Rel，可以明顯改善小鼠黑色素瘤模型與淋巴瘤模型的腫瘤情況，腫瘤生長得到明顯抑制［9］。因此，合理處理MDSCs可以有效提高腫瘤免疫活性。

1.2.3 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 M2型巨噬細胞成為腫瘤相關(guān)性巨噬細胞（tumor associated macro‐phages，TAMs），通過表達可溶性蛋白和細胞因子（如IL-10、基質(zhì)金屬蛋白酶、尿激酶型纖溶酶原激活劑、血管內(nèi)皮生長因子、血小板衍生生長因子等），在腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。表達的IL-10能夠有效地抑制細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的活化，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的快速增殖。過量的M2型巨噬細胞釋放特異性降解細胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9），從而促進了腫瘤細胞和腫瘤基質(zhì)細胞的遷移，導(dǎo)致了腫瘤細胞更加難以被免疫細胞的追蹤與殺傷［10］。此外，M2型巨噬細胞可以通過消耗L-氨基酸，產(chǎn)生促進腫瘤細胞增殖的鳥氨酸和多胺［11］。

1.3 免疫抑制性受體

1.3.1 CTLA4 通常機體內(nèi)T細胞的活性通過激活信號途徑和抑制信號途徑來調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致健康人體內(nèi)T細胞的活性平衡。通過抗原刺激信號和共刺激信號活化的T細胞能夠快速增殖和功能分化。當T細胞過度活躍時，細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated anti‐gen4，CTLA4）結(jié)合B7分子接到的抑制信號將終止T細胞的功能。CTLA4是CD28的同系物，對T細胞產(chǎn)生抑制信號，然后使其處于無活性狀態(tài)。理論上，CTLA4募集磷酸酯酶到T細胞受體的CD3ζ結(jié)構(gòu)域，從而通過免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的去磷酸化來減弱T細胞的功能。此外，一些研究已經(jīng)證明，T細胞的T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）激活能夠啟動CTLA4胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化，稱為免疫受體酪氨酸抑制基序，同時也能夠延長活化的T細胞表面CTLA4的表達［12］?；贑TLA4功能的原理，減少CTLA4內(nèi)源性表達或抑制其活性可以用于腫瘤的免疫治療。

1.3.2 PD-1 繼CTLA4后腫瘤免疫治療領(lǐng)域另一個重要免疫檢查點是程序性死亡受體1（pro‐grammed death 1，PD-1），它是一種細胞表面受體，屬于免疫球蛋白超家族，僅在活化的T淋巴細胞上表達。在結(jié)構(gòu)上，成熟的PD-1蛋白包含細胞外識別結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及細胞內(nèi)尾部。功能上，PD-1在抑制T細胞活性中起重要作用。具有兩個磷酸化位點的尾部，一個ITM和一個基于免疫受體酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序，它們均負調(diào)節(jié)T細胞受體信號。如果腫瘤細胞激活PD-1，也會產(chǎn)生抑制信號，從而阻止效應(yīng)T細胞的增殖，使T細胞不能及時有效地識別腫瘤細胞，從而使腫瘤細胞逃避免疫細胞的追殺?；贑TLA4和PD-1在不同抑制途徑中的功能，CTLA4抗體和PD-1抗體的聯(lián)合治療已經(jīng)成為通過檢查點抑制從而對抗腫瘤的有效方法［13］。

1.3.3 其他免疫檢查點 盡管CTLA4和PD-1通路能夠有效地負調(diào)節(jié)T淋巴細胞的免疫應(yīng)答，但它們僅代表抑制抗腫瘤應(yīng)答潛在靶點的“冰山一角”。隨著腫瘤免疫治療中T細胞的發(fā)展，隨后又發(fā)現(xiàn)多種抑制免疫應(yīng)答的免疫檢查點，例如淋巴細胞激活基因3（lymphocyte-activation gene3，LAG3），T細胞免疫球蛋白黏蛋白3（T-cellimmunoglobulin mucin 3，TM3）和T細胞活化的V域Ig抑制劑（Vdomain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）。蛋白LAG3是一種細胞耗竭的標記，在激活的T細胞和其他免疫細胞上廣泛表達，它是一種重要的抑制性受體，能夠以比CD4更高的親和力結(jié)合主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類（major histocompatibility complex class II，MHCⅡ），進而阻止抗腫瘤免疫反應(yīng)。在T細胞上表達的受體蛋白TIM3可以啟動TIM3/Galectin-9信號傳導(dǎo)途徑，其可以抑制淋巴細胞應(yīng)答并促進細胞凋亡［14］。VISTA是一種在造血細胞和白細胞上表達的負調(diào)節(jié)受體，可降低T細胞的活性和細胞毒性細胞因子的產(chǎn)生［15］。

1.4 缺乏趨化因子受體

CAR-T細胞治療實體瘤的主要障礙是T細胞難以滲入實體瘤組織內(nèi)部。趨化因子是一類能夠吸引白細胞到感染部位的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)多種免疫細胞進入腫瘤微環(huán)境，幫助T細胞進入腫瘤并影響腫瘤免疫和治療效果。一些實體瘤能夠分泌趨化因子，如趨化因子12（CXCL12）和趨化因子15（CXCL5），但腫瘤細胞抑制這些因子的分泌會不利于T細胞的滲透。相反，T細胞表面缺乏表達一些與實體瘤分泌的趨化因子相匹配的趨化因子受體［16］。一些報道顯示，雖然實體瘤能夠大量分泌趨化因子，如屬于C-C趨化因子家族的CCL2，但是相應(yīng)的趨化因子受體，如可特異性結(jié)合CCL2的CCR2b和CCR4，在T細胞上表達量很低，這導(dǎo)致T細胞歸巢能力的降低。

1.5 腫瘤抗原不均一性

眾所周知，CAR-T細胞通過scFv結(jié)構(gòu)識別并靶向腫瘤細胞表面抗原，scFv由單克隆抗體的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域抗體組成。膜蛋白CD19在幾乎所有的B細胞惡性腫瘤中均有廣泛表達，這導(dǎo)致了CD19特異性CAR-T細胞的治療效果令人鼓舞。然而，對于實體瘤，由于缺乏腫瘤特異性抗原以及腫瘤抗原的異質(zhì)性，CAR-T細胞治療的應(yīng)用受到嚴重限制。目前進行臨床試驗的CAR-T靶點見表1。

表1 處于臨床試驗階段的CAR-T實體瘤靶點

1.6 免疫系統(tǒng)中的其他免疫抑制因子

1.6.1 CD47 在人體免疫系統(tǒng)中，巨噬細胞基于靶細胞上吞噬信號（“吃我”）和抗吞噬信號（“不吃我”）之間的平衡發(fā)揮吞噬功能。抗吞噬信號取決于靶細胞上表達的CD47分子與巨噬細胞上呈遞的信號調(diào)節(jié)蛋白α（signal regulatory proteinα，SIRPα）之間的相互作用，導(dǎo)致SIRPα的ITM磷酸化?？缒さ鞍證D47在許多腫瘤細胞中均過度表達［17］。通常CD47-SIRPα介導(dǎo)的抗吞噬細胞信號允許腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。因此，為了增強免疫系統(tǒng)應(yīng)對腫瘤的能力，CD47可以用作腫瘤免疫治療領(lǐng)域的新靶點。

1.6.2 CD73和腺苷 CAR-T細胞治療實體瘤未取得成功很大程度上是由于腺苷的大量產(chǎn)生。腺苷由胞外腺苷一磷酸通過胞外酶催化產(chǎn)生，CD73在腫瘤細胞或免疫抑制性細胞上表達，有助于將具有免疫激活作用的ATP轉(zhuǎn)化為腺苷［18］。產(chǎn)生的腺苷促進腫瘤生長和疾病發(fā)展，導(dǎo)致T細胞和NK細胞的細胞毒性被抑制，細胞因子的產(chǎn)生和增殖被抑制從而抑制抗原呈遞細胞，促進Terg的增殖和抑制免疫活性，刺激MDSC和M2型巨噬細胞的極化［19］。

總之，在被抑制的免疫“監(jiān)視”條件下，CAR修飾的T細胞會面臨許多障礙。隨著對腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)的進一步研究，科學(xué)家開發(fā)了一些策略克服這些障礙，使得對于實體瘤應(yīng)用CAR-T成為可能。本文根據(jù)作用機制進一步描述了這些方法如何改善TME，進而增強T細胞功能。

2 提高CAR-T細胞功能的策略

2.1 選擇腫瘤特異性抗原

CAR結(jié)構(gòu)的抗原特異性直接決定了修飾T細胞的精確活性和安全性。然而，對于實體瘤，腫瘤抗原的異質(zhì)性導(dǎo)致無效的免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致難治性和復(fù)發(fā)性腫瘤。一些研究人員試圖找到腫瘤干細胞的標志物，這些標志物在腫瘤分化的早期階段被認為是腫瘤特異性抗原。有研究報道，生殖干細胞（POWIL2）異化激活產(chǎn)物（PL2L60）在各種血癌和實體癌瘤中廣泛表達，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時PIWIL2/PL2L60蛋白特異性單克隆抗體（克隆KAO3）可以抑制癌前干細胞在免疫缺陷小鼠內(nèi)的致瘤能力，也能有效抑制多種腫瘤生長，包括淋巴瘤、乳腺瘤、肺癌和宮頸癌等［20］。鑒定腫瘤特異性抗原為開發(fā)用于實體瘤的靶向療法提供了強有力的工具。

2.2 CAR-T細胞的浸潤和歸巢

2.2.1 趨化因子受體 為了增強T細胞對腫瘤的歸巢能力，一些趨化性手段給予T細胞強大的靶向?qū)嶓w瘤的能力。腫瘤細胞分泌的趨化因子與修飾T細胞上的趨化因子受體相結(jié)合可促進更多的T細胞到達實體瘤部位。對于惡性胸膜間皮瘤，同時表達CCR2b和間皮素特異性CAR-T細胞可增加其遷移至腫瘤部位并消除靶細胞的能力。此外，其他研究小組也已經(jīng)描述了類似的CAR方法，具有更強的運輸和抗腫瘤效力，例如在治療霍奇金淋巴瘤中使用表達CCR4的CD30特異性CAR-T細胞和在神經(jīng)母細胞瘤中使用表達CCR2b的GD2特異性CAR-T細胞［21］。在這些研究中，用功能性趨化因子受體修飾的CAR-T細胞在體內(nèi)具有顯著的腫瘤定位和抗腫瘤效力。

2.2.2 成纖維細胞活化蛋白 先前的報道已經(jīng)證明腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibro‐blasts，CAFs）能夠促進血管生成，在實體瘤的進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，CAFs是腫瘤惡性進展的關(guān)鍵決定因素，是腫瘤治療的重要目標。靶向CAFs是CAR-T治療實體瘤的新方法。Schuberth等［22］利用CAR開發(fā)了一種特異性針對成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）的T細胞，F(xiàn)AP在CAFs上大量表達，在異種移植間皮瘤的動物模型試驗結(jié)果中顯示，F(xiàn)APCAR-T治療能顯著提升生存時間，提高生存率。Wang等［23］研究表明，靶向FAP陽性細胞通過表位擴展增強抗腫瘤免疫活性。在小鼠間皮瘤與肺癌模型中，使用FAP-CAR治療3 d后，內(nèi)源性CD4+T細胞活化，隨后內(nèi)源性CD69+，CD8+T細胞浸潤數(shù)量增加。使用CAF-CAR-T細胞進行的臨床試驗正在進行中（NCT01722149）?？傊邢駽AFs的治療策略是根除腫瘤的有效方法。

2.2.3 整合素 對于實體瘤而言，修飾的T細胞缺乏浸潤腫瘤實質(zhì)的能力，導(dǎo)致其體內(nèi)效力十分有限。一般而言，整合素αvβ3在實體瘤的新生血管內(nèi)皮細胞表面高度表達，靶向整合素是可以解決T細胞缺乏浸潤能力的問題。因此，F(xiàn)u等［24］提出了一種很有發(fā)展前景的策略，即將T細胞植入能偶靶向αvβ3的含有echistatin的CAR（T-eCAR）。T-eCAR細胞的回輸影響腫瘤新生血管系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤顯著縮小，但對正常組織的血管沒有脫靶效應(yīng)。一項基于靶向整合素β7的研究設(shè)計了MMG49 CAR特異性靶向整合素β7活性構(gòu)象，該靶點在大多數(shù)骨髓瘤細胞表面表達且具有活性構(gòu)象，體內(nèi)實驗結(jié)果表明，MMG49 CAR-T會特異性殺死小鼠體內(nèi)的骨髓瘤細胞，具有顯著的抗腫瘤活性且對正常細胞沒有傷害［25］。

2.3 共表達免疫因子和酶

細胞因子是一種信號蛋白，具有顯著增強或消除CAR-T細胞功能的能力。與免疫刺激細胞因子共同表達的CAR可顯著提高免疫抑制性，例如IL-12可以調(diào)控T細胞多種T細胞的發(fā)育，對免疫反應(yīng)的方向以及免疫相關(guān)疾病具有顯著影響；IL-15在T細胞運輸過程中起關(guān)鍵作用。同時為了進一步提升抵抗TME的能力，T細胞被改造以表達一些細胞因子，如IL-12或IL-15，并分泌一些酶，如過氧化氫酶等，結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 共表達細胞因子的CAR-T結(jié)構(gòu)

2.3.1 IL-12 免疫調(diào)節(jié)細胞因子IL-12能夠促進免疫抑制的快速逆轉(zhuǎn)，在T淋巴細胞和其他免疫細胞的活化中起重要作用，是抗腫瘤免疫的有效誘導(dǎo)劑。通過設(shè)計表達IL-12的CAR-T細胞可以作為改進CAR-T的新思路。Pegram等［26］報道，分泌IL-12的靶向CD19的CAR-T細胞能消除全身性腫瘤并獲得最佳的抗腫瘤反應(yīng)。另一個研究也顯示，通過基因工程改造CAR-T細胞使其分泌微量IL-12，體內(nèi)實驗中，與4只未經(jīng)治療的小鼠相比，分泌IL-12的CAR-T細胞療法顯著提高了7只淋巴瘤小鼠的存活時間。另外，分泌IL-12的CAR-T細胞稱為TRUCKs，不僅增強修飾T細胞的活化和細胞毒性，而且還導(dǎo)致Th1極化狀態(tài)，吸引內(nèi)源性T細胞和其他先天免疫細胞根除腫瘤細胞。

2.3.2 IL-15 一些研究表明，細胞因子IL-15通過結(jié)合IL2Rβγc復(fù)合物，能夠有效增強記憶性CD8+T細胞和NK細胞的功能，而不激活具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞。通過設(shè)計表達IL-15的CAR-T細胞便可以增強免疫細胞的功能，改善突破腫瘤微環(huán)境。Chow等［27］證明IL-15在體內(nèi)CD8+T細胞的運輸中發(fā)揮重要作用。因此，表達IL-15的T細胞可以作為消除免疫抑制微環(huán)境中靶細胞的有效武器。有研究聯(lián)合表達IL-15的CD19 CAR-T細胞療法，比較CD19 CAR-T與IL15-CD19 CAR-T抗腫瘤能力，給予抗原刺激后，IL-15 CD19 CAR-T具有比CD19 CAR-T細胞更大的增殖能力，并且在異種移植淋巴瘤動物模型中，注射IL-15 CD19 CAR-T細胞的小鼠腫瘤消除更快，具有更強的腫瘤殺傷活性，且不對正常細胞進行殺傷［28］。上述研究證明了CAR-T細胞通過聯(lián)合分泌IL-15可以增強CAR-T細胞的增殖能力提高抗腫瘤活性。

2.3.3 過氧化氫酶 在實體瘤中，浸潤的T細胞經(jīng)常會遇到豐富的活性氧，這是腫瘤微環(huán)境的一個標志，會損害修飾T細胞的抗腫瘤活性。保護T細胞免受氧化應(yīng)激的一種方法是設(shè)計一種CAR-T細胞共同表達過氧化氫酶。Ligtenberg等［29］開發(fā)了一種新型T細胞模式（稱為CAR-CAT-T細胞），具有共表達過氧化氫酶的CAR，其催化過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧，從而改善腫瘤微環(huán)境，提升免疫細胞的抗腫瘤活性。作者還在體外對癌胚抗原（CEA）和從表皮生長因子受體-2（HER2）CAR-T細胞進行了檢測，發(fā)現(xiàn)與單純CAR相比，此類CAR-T具有較低的氧化狀態(tài)，并具有較好的增殖活力和細胞毒性。工程化的T細胞可以通過代謝過氧化氫和減少氧化應(yīng)激介導(dǎo)的抑制來減少腫瘤的氧化狀態(tài)，并保持其抗腫瘤活性。

2.3.4 HVEM(皰疹病毒侵入介體)皰疹病毒侵入介體（herpesvirus entry mediator，HVEM，圖4），被稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員14（TNFRSF14），是中心淋巴瘤中最常見的突變基因，這些突變可破壞與BTLA（B and T lymphocyte attenuator，B、T淋巴細胞衰減因子）的抑制性受體之間的相互作用，通過惡化淋巴基質(zhì)活化和增加濾泡輔助性T細胞的招募從而誘導(dǎo)淋巴細胞癌生長所需要的關(guān)鍵微環(huán)境。工程化T細胞可以攜帶HVEM從而阻止HVEM-BTLA作用被破壞。HVEM的丟失通常驅(qū)動中心淋巴瘤的發(fā)生并誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境。Boice等［30］設(shè)計攜帶可溶性HVEM的CD19特異性CAR-T細胞，通過釋放可溶性HVEM在局部增強對淋巴瘤的治療活性，攜帶HVEM的CD19 CAR-T具有更強大的抗腫瘤活性。這些研究結(jié)果也闡明了一種新方法，來修復(fù)腫瘤抑制性的HVEM-BTLA交互，并抑制了淋巴瘤細胞的生長。此外該方法也表明，CAR-T細胞不僅直接攻擊腫瘤細胞，同時還具有精確治療的藥物傳遞工具。

圖4 皰疹病毒侵入介體（HVEM）缺失機制

2.4 修飾一些相關(guān)受體

2.4.1 4-1BBL 最近的一些報道顯示，第2代CAR組成型表達CD28配體或4-1BB配體（CD80或4-1BBL）可以增強體內(nèi)T細胞活性，當4-1BB與4-1BBL或抗體激動劑結(jié)合，共刺激信號可促進T細胞的增殖和活化，并抑制活化誘導(dǎo)的細胞凋亡，進而增強T細胞的免疫殺傷功能。同時，誘導(dǎo)單核細胞等活化，促進細胞因子的分泌，使單核細胞、樹突狀細胞等在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。這可能以雙向的方式在T細胞內(nèi)直接傳導(dǎo)信號，并間接觸發(fā)TME中其他表達4-1BB的免疫細胞。在第2代CAR組成型表達4-1BBL的研究中，與正常的CD19 CAR-T相比，表達4-1BBL的CAR-T細胞在體內(nèi)實驗以最低劑量注射，且在回輸CAR-T后一周便消除了腫瘤，顯著優(yōu)于CD19 CAR-T［31］。因此，共表達4-1BBL可稱為CAR-T設(shè)計的一種有效思路。

2.4.2 CD40L 實體瘤的免疫治療需要有效地破壞免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。CD40-CD40L介導(dǎo)的信號能夠誘導(dǎo)抗原呈遞細胞的活化，增強對弱免疫原性腫瘤細胞抗原的呈遞，從而誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫。設(shè)計CAR-T細胞表達CD40L便可以激活該信號通路，增加其抗腫瘤活性。Marigo等［32］證實在樹突狀細胞分泌腫瘤壞死因子時，CD40/CD40L信號通路對與CD8+T細胞介導(dǎo)的腫瘤排斥是必須的，CD8+T細胞是有效抗腫瘤細胞免疫的核心。另外CD40分子與活化的T細胞表面CD40L相互作用，增強T細胞的細胞毒活性，增加細胞因子的釋放，有效提高宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，可以設(shè)想通過將CAR修飾T細胞與CD40-CD40L途徑組合來實現(xiàn)腫瘤的消除。

2.4.3 DN TGF-βR Dominant-negative TGF-β受體（DN TGF-βR）是一類TGF-β的受體，可以結(jié)合TGF-β，從而減少TGF-β的量，進而減少免疫抑制效應(yīng)。TME中存在許多由腫瘤細胞分泌的免疫抑制性細胞因子，包括顯著抑制腫瘤特異性免疫的TGF-β?；诖藱C制，減少T細胞表面該受體的表達是克服TGF-β誘導(dǎo)免疫抑制的有效策略。Bol‐lard等［33］證明EBV特異性T細胞表達DN TGF-βR可以抑制TGF-B的抑制作用，從而延長T細胞存活時間，體內(nèi)試驗中，表達DN TGF-βR的CAR-T細胞在模型體內(nèi)的存活時間明顯優(yōu)于正常的CAR-T細胞，從而提升CAR-T細胞在體內(nèi)的作用時間，提升抗腫瘤活性。在臨床試驗NCT03089293涉及前列腺癌的治療過程中，在前列腺特異性膜抗原靶向CAR載體中表達dominant-negative TGFβ受體，以減少TGF-β抑制T細胞的活性的作用。目前該臨床試驗還處于Ⅰ期。

2.5 阻斷免疫檢查點

先前的報道顯示，實體瘤采用各種對策來削弱T細胞的細胞毒性，包括T細胞表達的免疫檢查點。這些在活化的T細胞上表達的免疫性受體與表達在靶細胞上的配體具有高親和力，有效抑制T細胞的效力。為了克服這一障礙，一些有效的技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，包括單克隆抗體（mAb）和基因編輯。對于mAb免疫療法，與免疫檢查點阻斷相關(guān)的臨床試驗已經(jīng)證明，mAb可以逆轉(zhuǎn)T細胞耗竭并恢復(fù)抗腫瘤免疫性，如抗PD-1的mAb，抗LAG3的mAb和抗BISTA的mAb。

CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)了破壞免疫檢查點來重新編程T細胞的非病毒方法。Su等證明通過電轉(zhuǎn)染編碼sgRNA和Cas9的治理來敲除T細胞的PD-1，導(dǎo)致PD-1表達的顯著降低，細胞毒性顯著增強。Gao等［34］證明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除CTLA4的細胞毒性T細胞能夠抑制腫瘤生長并促進腫瘤根除。因此，包括CAR-T細胞和檢查點阻斷在哪的一體化方法有助于提高T細胞的功效。

為了逆轉(zhuǎn)PDL-1介導(dǎo)的T細胞耗竭，Prosser等［35］提供了一種新策略，通過將PD-1的跨膜和胞內(nèi)域與CD28進行交換，從而將PD-1轉(zhuǎn)化為T細胞共刺激受體。研究表明，腫瘤PDL1能夠顯著刺激表達PD-1，CD28嵌合受體的T細胞，導(dǎo)致細胞因子分泌增加并增加細胞毒性。

3 應(yīng)用前景

CAR-T細胞療法在一些針對血液惡性腫瘤的臨床試驗中取得巨大成功，為治療富含免疫抑制因子的實體瘤提供了一種可行的方案。最近幾年，免疫抑制環(huán)境的特征已經(jīng)詳細闡明，提出了一些能夠讓CAR-T細胞克服這些障礙和增強腫瘤消除的新方法。有研究報道聯(lián)合使用特殊設(shè)計的分子佐劑可以增強CAR-T的殺傷活性，也為探索CAR-T的實體瘤治療提供了新的思路與方向［36］。借鑒于CAR-T治療實體瘤的研究，在抗衰老方面CAR-T的應(yīng)用也加速進行，近些年就有多篇報道關(guān)于CAR-T抗衰老研究，主要是應(yīng)用于直接對抗衰老細胞［37］，其基礎(chǔ)也是基于CAR-T的實體瘤治療。本文概述了實體瘤TME對免疫監(jiān)視的抑制機制，并探討了通過優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)和改善腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制環(huán)境來增強CAR-T細胞功效的一些有前景的方法。為了增強CAR-T細胞治療實體瘤的療效，通過修飾T細胞以維持細胞毒性，同時通過重塑改善實體瘤腫瘤微環(huán)境以增強效應(yīng)細胞的療效，以此來達到CAR-T細胞治療實體腫瘤的目的。