寧晶璇

（山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院內(nèi)科，山西 運(yùn)城，044000）

0 引言

在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌是第7大常見癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第2大原因[1]。肝細(xì)胞癌因其起病隱匿、早期浸潤(rùn)生長(zhǎng)并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)使大部分患者就診時(shí)已失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[2]。近年來已經(jīng)開展了大量針對(duì)肝細(xì)胞癌分子靶向治療及免疫治療的研究，但是隨著藥物的臨床運(yùn)用，耐藥率逐漸上升，肝細(xì)胞癌的總體發(fā)病率仍在不斷增加[3]。因此研究肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

E2F轉(zhuǎn)錄因子家族（E2Fs）是生物體中極其重要的一組轉(zhuǎn)錄基因，在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、衰老、DNA損傷反應(yīng)和DNA修復(fù)中發(fā)揮重要作用[4,5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)一些E2F轉(zhuǎn)錄因子家族對(duì)多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用和特點(diǎn)[6-9]。本研究對(duì)肝細(xì)胞癌中8個(gè)E2F轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了深入而全面的生物信息學(xué)分析，并基于幾個(gè)大型公共數(shù)據(jù)庫(kù)評(píng)估了其作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力，從而為臨床醫(yī)生選擇合適的治療靶點(diǎn)和更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌患者的長(zhǎng)期預(yù)后提綜合數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 分析E2Fs在肝細(xì)胞癌組織中轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平及臨床病理參數(shù)

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/) 是一個(gè)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的在線分析和挖掘癌癥數(shù)據(jù)的網(wǎng)站工具[10]。本研究通過運(yùn)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)分析E2Fs在肝細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)以及其與肝細(xì)胞癌腫瘤分期和分級(jí)的關(guān)系。

1.2 分析E2Fs在肝細(xì)胞癌組織中蛋白表達(dá)水平

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/) 是一個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，旨在利用各種組學(xué)技術(shù)繪制人類蛋白質(zhì)的組織和細(xì)胞分布信息[11]。本研究從人蛋白質(zhì)圖譜中尋找并提取了肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中E2F1/2/8免疫組化圖像進(jìn)行比較。

1.3 分析E2Fs與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系及檢索E2Fs相似基因

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/) 是一個(gè)基于TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析和可視化的網(wǎng)站，提供腫瘤與正常組織的差異表達(dá)譜分析、病理分期、患者生存分析、相似基因的檢測(cè)與分析[12]。本研究從GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得E2Fs在OS和RFS肝癌患者中表達(dá)的預(yù)后數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。同時(shí)利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索E2Fs的相似基因進(jìn)行富集分析。

1.4 E2Fs及其相似基因的GO和KEGG富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/) 是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，目前的版本是david6.8，它可以為大規(guī)模的基因或蛋白質(zhì)列表提供全面的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物信息[13]。本研究在david6.8數(shù)據(jù)庫(kù)中用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes）對(duì)肝細(xì)胞癌中不同表達(dá)的E2Fs和160個(gè)相鄰基因進(jìn)行了富集分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

表達(dá)水平采用Student’s t-test，P<0.05提示有顯著性差異。生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2Fs在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

為了解E2Fs在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況，我們運(yùn)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肝細(xì)胞癌組織和正常組織中的E2Fs的mRNA水平進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中E2F1/2/3/4/5/6/7/8的mRNA表達(dá)量與正常組織相比明顯升高（均P<0.001）（見圖1）。接著我們應(yīng)用HPA數(shù)據(jù)庫(kù)探索E2Fs在肝細(xì)胞癌中的蛋白表達(dá)水平，在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中我們找到了E2F1,E2F2和E2F8在內(nèi)的3個(gè)E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員在肝細(xì)胞癌中的免疫組化結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)E2F1的蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組織，而E2F2和E2F8的蛋白表達(dá)水平與正常組織沒有顯著差異（見圖2）。

圖1 E2Fs 在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況（＊＊＊P<0.001）

圖2 E2F1/2/8在肝癌組織中免疫組化結(jié)果

2.2 E2Fs與肝細(xì)胞癌腫瘤分期和分級(jí)的關(guān)系

在發(fā)現(xiàn)E2Fs家族成員在肝細(xì)胞癌組織轉(zhuǎn)錄水平高表達(dá)后，我們利用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析E2Fs 轉(zhuǎn)錄水平與肝細(xì)胞癌腫瘤分期和分級(jí)的關(guān)系。結(jié)果提示：總體來說，在肝細(xì)胞癌腫瘤分期中E2Fs表達(dá)水平均隨著腫瘤分期的增加逐漸升高。E2F1/2/3/6/7/8表達(dá)量均在3期最高，E2F4，E2F5表達(dá)量在腫瘤4期的表達(dá)量最高。（可能是因?yàn)槟[瘤4期包含的樣本量過于少的緣故。）在腫瘤分級(jí)中E2Fs的表達(dá)水平隨著腫瘤分級(jí)的增加逐漸升高（見圖3、圖4）。提示E2Fs 轉(zhuǎn)錄水平隨著肝細(xì)胞癌腫瘤分期和腫瘤分級(jí)的增加而升高，提示E2Fs的轉(zhuǎn)錄水平與肝癌患者的臨床病理階段明顯相關(guān)。

圖3 E2Fs與肝細(xì)胞癌腫瘤分期關(guān)系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001.

圖4 E2Fs 與肝細(xì)胞癌腫瘤分級(jí)的關(guān)系 ＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001

2.3 E2Fs與肝細(xì)胞癌患者生存期的關(guān)系

我們應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)探索E2Fs的轉(zhuǎn)錄水平與肝細(xì)胞癌患者總生存期（OS）和無復(fù)發(fā)生存期（RFS）的關(guān)系。分析結(jié)果提示高表達(dá)E2F1/2/5/6/7/8的肝細(xì)胞癌患者的OS明顯低于低表達(dá)的患者，而高表達(dá)E2F3/4的肝細(xì)胞癌患者的OS與低表達(dá)患者沒有明顯區(qū)別。對(duì)于RFS而言，高表達(dá)E2F1/2/3/5/6/7/8患者的RFS明顯低于低表達(dá)者，而E2F4的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的RFS無明顯關(guān)系（見圖5）。提示低表達(dá)E2F1/2/5/6/7/8的肝細(xì)胞癌患者OS和RFS預(yù)后較好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成為肝細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后生物學(xué)指標(biāo)。

2.4 E2Fs及其相似基因富集分析

接下來我們運(yùn)用生物信息學(xué)中的比對(duì)思想，即與目標(biāo)基因越相似的基因越有可能發(fā)揮相應(yīng)的功能。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)尋找與E2Fs的相似基因160個(gè)（每個(gè)E2F成員找最相似基因20個(gè)，共160個(gè)相似基因）。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)E2Fs及其相似基因進(jìn)行GO和KEGG分析。通過GO分析將靶標(biāo)基因在細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物學(xué)過程（BP）中進(jìn)行富集分析，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法找到最顯著富集的生物學(xué)注釋。通過KEGG分析富集靶標(biāo)基因產(chǎn)物在細(xì)胞中所在的通路。

GO分析結(jié)果提示：富集最多的細(xì)胞組分（GO:CC）是：細(xì)胞核、核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、膜、核仁、中心體、微管及轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物；富集最多的分子功能（GO:MF）是：蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、多聚（A）RNA結(jié)合、RNA結(jié)合、核苷酸結(jié)合、酶結(jié)合、微管結(jié)合、核心啟動(dòng)子結(jié)合、單鏈DNA依賴性ATP酶活性和DNA鉗夾加載器活性；富集最多的生物學(xué)過程（GO:BP）是：細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、有絲分裂核分裂、DNA修復(fù)、mRNA剪接、通過剪接體、有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換、細(xì)胞對(duì)DNA損傷刺激的反應(yīng)、姐妹染色單體內(nèi)聚、DNA損傷反應(yīng)和p53類介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)：在E2Fs及其相關(guān)基因可能通過參與細(xì)胞周期、癌中的MicroRNAs、DNA復(fù)制、錯(cuò)配修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)等通路，參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展（見圖6）。

圖6 E2Fs及其相似基因富集分析結(jié)果

3 討論

肝細(xì)胞癌是全球常見的惡性腫瘤之一，我國(guó)是肝癌大國(guó)，肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和死亡率均超過全世界50%[14]。隨著第一代肝細(xì)胞癌分子靶向藥物多靶點(diǎn)酪氨酸酶抑制劑索拉菲尼上市，開啟了肝細(xì)胞癌分子靶向治療的新時(shí)期，PD-1單抗等免疫治療藥物被FDA批準(zhǔn)上市運(yùn)用于臨床，為腫瘤晚期、無手術(shù)機(jī)會(huì)的肝細(xì)胞癌患者帶來了希望[15]。但隨著靶向藥物的臨床應(yīng)用，耐藥的發(fā)生率逐漸升高，上述分子靶向治療藥物及免疫治療藥物的整體有效率依然有限，診斷和預(yù)后的分子靶標(biāo)依然缺乏。

近年來已有許多的研究評(píng)估E2F轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在肝細(xì)胞癌中臨床價(jià)值，但對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子家族在肝細(xì)胞癌中的診斷及預(yù)后作用的研究仍不全面。本研究對(duì)E2Fs在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)、腫瘤分期分級(jí)、預(yù)后等方面進(jìn)行深入分析及研究，為臨床尋找新型肝細(xì)胞癌診斷和預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提綜合數(shù)據(jù)。

E2F1是經(jīng)典的E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，也是E2F家族中研究最深入的成員。它通過編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞周期G1期/S期轉(zhuǎn)變過程中扮演著重要角色。本研究通過運(yùn)用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)E2F1 mRNA水平和蛋白水平在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，并且高表達(dá)E2F1的肝細(xì)胞癌患者具有更差的生存期。結(jié)果提示E2F1可能為肝細(xì)胞癌診斷及預(yù)后的標(biāo)志物。E2F2是E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等相關(guān)細(xì)胞功能有一定的影響。有研究表明E2F2在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)上調(diào)，miR-218可通過抑制肝細(xì)胞癌中的E2F2,從而抑制肝癌細(xì)胞增殖[17]。本研究發(fā)現(xiàn)E2F2在轉(zhuǎn)錄水平在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者的生存期密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)E2F3、E2F4mRNA在肝細(xì)胞癌組織中明顯升高，但與肝細(xì)胞癌的預(yù)后無顯著性差異，提示E2F3，E2F4對(duì)肝細(xì)胞癌的預(yù)后預(yù)測(cè)作用可能較弱。

近年來多項(xiàng)研究提示E2F5、E2F6、E2F7和E2F8在多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，其中有研究發(fā)現(xiàn)F2F5與CDK13相互作用促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[19]；E2F6在惡性黑素瘤中高表達(dá)，敲減A375細(xì)胞E2F6基因可能通過拮抗β聯(lián)蛋白信號(hào)抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[20]。另外，Moreno等在對(duì)成年大鼠進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)E2F7是肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)抑制因子[7]；E2F8在甲狀腺乳頭狀癌組織中高表達(dá)，且與其病理分期呈正相關(guān)[21]。本研究通過綜合分析發(fā)現(xiàn)E2F5/6/7/8在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，且表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的臨床分期及分級(jí)相關(guān)。低表達(dá)E2F5/6/7/8的肝細(xì)胞癌患者具有更高的生存期，提示E2F5/6/7/8同時(shí)具有診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)作用。

綜上所述，本研究通過分析E2F轉(zhuǎn)錄因子家族8個(gè)成員在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)、與臨床分期分級(jí)的關(guān)系、與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上E2Fs在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并且與肝細(xì)胞癌的臨床病理分期明顯相關(guān)。低表達(dá)E2F1/2/5/6/7/8的肝細(xì)胞癌患者OS和RFS預(yù)后較好，提示E2F1/2/5/6/7/8可能成為肝細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后生物學(xué)指標(biāo)。GO和KEGG富集結(jié)果提示E2F轉(zhuǎn)錄因子的功能主要集中在細(xì)胞周期調(diào)控方面，提示E2Fs可能通過細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果說明，E2F1/2/5/6/7/8可能作為肝細(xì)胞癌的獨(dú)立生存預(yù)后指標(biāo)，從而為臨床中尋找肝細(xì)胞癌靶基因及靶向藥物提供新的線索和思路。