段博芳，程文杰，楊 勇，趙 珍，呂 艷，姜關(guān)樹，呂艷彩，楊建發(fā)，張文東*

(1.云南省動物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；3.大理市喜洲鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南大理 671004)

多頭帶絳蟲(Taeniamulticeps)屬于絳蟲綱(Cestoidea)、圓葉目(Cyclophyllidea)、帶科(Taeniidae)、帶屬(Taenia)[1]。多頭帶絳蟲中絳期幼蟲腦多頭蚴(Coenuruscerebralis)寄生于牛、羊等草食動物的大腦、脊髓內(nèi)，可引起一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病——腦多頭蚴病(Cerebral coenurosis)，成蟲寄生于犬、狼、狐等犬科動物的小腸。腦多頭蚴病呈世界性分布，人體病例報道超過100例[2]。在中國多地均有報道，其中西北、華北、東北等廣大牧區(qū)較為常見[3]。

線粒體基因(mitochondrial DNA，mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定遺傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn),已被應(yīng)用于寄生蟲分子分類、群體遺傳的研究[4-6]。線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基1(mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1，cox1)基因比較保守，適宜于寄生蟲分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[7-9]。

云南省已有關(guān)于山羊感染多頭蚴的報道[10]。診斷方法主要依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病原學(xué)檢查，云南地區(qū)腦多頭蚴尚缺乏分子水平的研究。云南昭通地區(qū)存在多種優(yōu)良的牛、羊品種，但缺乏對寄生蟲的重視和認(rèn)識，導(dǎo)致寄生蟲感染種類多、感染情況嚴(yán)重，從而降低了養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[11]，有必要加強(qiáng)昭通地區(qū)寄生蟲感染情況的調(diào)查。本研究對來自云南省昭通市的山羊腦多頭蚴線粒體cox1基因進(jìn)行了擴(kuò)增與分子鑒定，分析其cox1序列，研究其與帶科帶屬其他絳蟲的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以期為腦多頭蚴的分子診斷提供相關(guān)參考，同時為該地區(qū)腦多頭蚴病的防控提供有關(guān)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本研究樣品來源于云南省昭通市某養(yǎng)殖場1只山羊的腦部。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，天根生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖粉、2×SanTaqPCR Mix 預(yù)混液(含藍(lán)染料)，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、6×Loading buffer，TaKaRa試劑公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 光學(xué)顯微鏡(XS-212-105)，江南永新光學(xué)有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴箱(HH-W600)，深華生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高速臺式離心機(jī)(Model CF-10)，Wise Spin公司產(chǎn)品；PCR儀( PTC-1148)，Bibby Scientific公司產(chǎn)品；水平電泳儀(BG-subMINI)，BAYGENE公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(WGD-30)，大韓科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀測 將蟲體置于干凈的平皿中，用光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)，之后將其保存于750 mL/L酒精中。

1.2.2 DNA的提取 取3個原頭蚴，分別命名為ZT1、ZT2、ZT3，用ddH2O沖洗干凈，將ddH2O吸干并將原頭蚴分別放置于新的1.5 mL的離心管，對樣品進(jìn)行無菌前處理，分別加入200 μL緩沖液GA與20 μL蛋白酶K，將樣品置于加熱至56 ℃的水浴鍋里消化過夜。按DNA提取試劑盒說明書提取樣品基因組DNA，然后將其保存在-20 ℃。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 參考Bowles J等[12]擴(kuò)增cox1基因的引物JB3和JB4.5。PCR擴(kuò)增引物序列：上游引物JB3:5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24bp)，下游引物JB4.5: 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′( 24bp) 。預(yù)期擴(kuò)增目的片段的大小約 450 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

反應(yīng)擴(kuò)增體系為25 μL：Mix酶12.5 μL，上、下游引物(50 pmol/μL)各0.5 μL，超純水10.0 μL，模板DNA為1.5 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，45 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min，16 ℃反應(yīng)結(jié)束。同時設(shè)陰性對照。取4 μL PCR產(chǎn)物于15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳儀上檢測，檢測結(jié)果可通過紫外透射儀拍照記錄。

1.2.4cox1基因序列測定及其進(jìn)化分析 將PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果進(jìn)行拼接。序列拼接成功后進(jìn)行Blast在線比對分析。下載GenBank中部分帶屬絳蟲cox1基因序列(表1)。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為相鄰法(Neighbor joining method)，以細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)作為外群，Bootstrap置信值重復(fù)抽樣1 000次。用DNA Star軟件MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。

表1 部分帶屬絳蟲cox1基因序列信息

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

肉眼可見許多白色、近似卵圓形的原頭蚴，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)頭節(jié)上有4個吸盤和1個頂突，頂突上有小鉤(圖1)。根據(jù)觀察結(jié)果，結(jié)合寄生部位，初步推斷為腦多頭蚴。

a.原頭蚴(40×)；b.頭節(jié)(100×)

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

3個腦多頭蚴樣品均成功擴(kuò)增出cox1基因片段，與預(yù)期目的片段長度相符，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

2.3 cox1基因測序與序列分析結(jié)果

樣品cox1基因片段長度為446 bp，與GenBank收錄的多頭帶絳蟲分離株(登錄號:KR604808.1)的同源性均高于99.1%。DNAMAN軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個腦多頭蚴樣品一致性為99.85%，其中ZT1分離株和ZT3分離株序列完全一致，共得到2個不同的序列，cox1序列的A、T、C、G堿基的平均含量分別為22.65%、45.14%、10.31%、21.90%，序列中A+T的含量(67.79%)遠(yuǎn)高于G+C的含量(32.21%)，2個位點(diǎn)發(fā)生堿基突變(C/T位于436，G/C位于437)。DNA Star軟件MegAlign程序分析3例樣品的同源性為100.0%，與帶科帶屬其他絳蟲同源性為88.2%～94.5%，與帶屬其他多頭帶絳蟲同源性為97.2%～100.0%，其中與中國甘肅、中國青海等國內(nèi)分離株同源性為97.2%～100.0%。

基于cox1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有多頭帶絳蟲分離株以85%的置信度匯成一支，本研究中的云南分離株與伊朗、中國攀枝花、希臘等分離株親緣關(guān)系較近，而與中國甘肅、中國青海、埃及等多個地區(qū)的分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分離株沒有按照同一地區(qū)或宿主而相應(yīng)聚成一個分支(圖3)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～3.ZT1,ZT2,ZT3；4.陰性對照

圖3 cox1基因片段進(jìn)化樹分析

3 討論

形態(tài)學(xué)觀察是鑒定寄生蟲的重要手段，但是此種方法存在局限性，也有可能出現(xiàn)同種異名的情況。分子檢測為寄生蟲的快速鑒定及分類提供了強(qiáng)有力的支持。云南地區(qū)目前已有黑山羊感染多頭蚴的報道[10]，診斷依據(jù)主要為臨床癥狀和病原學(xué)檢查。本研究在形態(tài)學(xué)觀察的基礎(chǔ)上利用cox1基因作為分子標(biāo)記鑒定山羊感染了多頭帶絳蟲幼蟲——腦多頭蚴，通過分子檢測確定云南地區(qū)在山羊之中存在腦多頭蚴的流行。進(jìn)化樹顯示，多頭帶絳蟲與帶科帶屬其他絳蟲形成不同的分支，表明cox1基因可以作為一種有效的分子標(biāo)記用于多頭帶絳蟲的鑒定及帶科絳蟲的分類研究。本研究中腦多頭蚴分離株cox1基因序列存在差異，表明發(fā)生變異或可能存在不同的基因型，這與Zhang Y等[13]研究發(fā)現(xiàn)腦多頭蚴在cox1基因處發(fā)生遺傳變異較為常見相符合。

多頭蚴曾根據(jù)寄生部位不同而被分為腦多頭蚴、格氏多頭蚴和斯氏多頭蚴[14]。之后的研究表明格氏多頭絳蟲和多頭帶絳蟲為同一個種[15-16]。在進(jìn)化樹中，多頭帶絳蟲分離株并未按照寄生部位聚類，伊朗格氏多頭蚴分離株(HM101469.1)與其他多頭帶絳蟲分離株相聚共同形成了一個大分支，表明格氏多頭蚴是多頭帶絳蟲的同種異名，與郝桂英等[17]的研究結(jié)論相同。分離株也未按照牛、羊等宿主或者地區(qū)進(jìn)行聚類。

世界多地均有羊感染腦多頭蚴的報道。于合宅[18]調(diào)查發(fā)現(xiàn)河北省部分地區(qū)山羊腦多頭蚴感染率為2.38%，同時調(diào)查范圍內(nèi)犬的多頭帶絳蟲感染率達(dá)15.33%。李連芳[19]報道了青海省多個地區(qū)羊多頭蚴病發(fā)病率平均為1.44%，病死率為47.65%，其中海晏地區(qū)病死率高達(dá)89.50%。意大利屠宰綿羊中腦多頭蚴的感染率為0.35%[20]。約旦屠宰綿羊中腦多頭蚴的感染率為2.66%[21]。腦多頭蚴病可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重者甚至?xí)斐裳蛩劳觯o養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。針對患病羊，可以通過手術(shù)進(jìn)行治療[22]，也可選用吡喹酮等藥物進(jìn)行治療[23]。昭通地區(qū)曾存在多種絳蟲的流行，且犬與絳蟲的流行存在密切的聯(lián)系[24]，防治腦多頭蚴病需加強(qiáng)對犬的控制?？蓪θM(jìn)行定期驅(qū)蟲，并及時無害化處理糞便。據(jù)孫麗仙等[10]報道，云南會澤地區(qū)有19頭黑山羊感染多頭蚴，但云南地區(qū)山羊腦多頭蚴的感染狀況、分布狀況、分子生物學(xué)流行特點(diǎn)等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不詳，此研究為進(jìn)一步開展云南省山羊腦多頭蚴的流行病學(xué)調(diào)查提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。