徐偉麗 姚文山 賈利國 侯穎征 陳 靜

1華北理工大學生命科學學院 河北唐山 063210；2盤錦職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)療護理學院

美國癌癥學會發(fā)表的《2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》，對185個國家/地區(qū)中的36種癌癥發(fā)病率和死亡率進行了統(tǒng)計，2020年全球癌癥新發(fā)病例和癌癥死亡病例分別為1930萬例和1000萬例[1]。世界范圍內(nèi)癌癥發(fā)病率和死亡率的負擔正在迅速增長，癌癥是全球主要的公共衛(wèi)生問題。C-1027是從我國湖北省土壤中分離的球孢鏈霉菌產(chǎn)生的抗腫瘤抗生素，對腫瘤細胞具有強烈的細胞毒性作用。細胞自噬通過將受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)靶向到溶酶體，然后在其中降解，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)的基本細胞過程[2-3]。細胞自噬水平的變化與腫瘤密切相關(guān)，目前對自噬發(fā)揮何種作用的研究已有很多，如自噬能在營養(yǎng)缺乏等不友好的環(huán)境下促進肝癌的生長[4-5]。也有研究表明自噬能夠抑制肝腫瘤的發(fā)生，ATG在其中發(fā)揮重要作用[6]。因此，本研究以人肝癌細胞為模型，研究了C-1027對肝癌細胞的抗腫瘤作用，并初步探討C-1027對肝癌細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 肝癌細胞系BEL-7402及C-1027均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所饋贈。

1.2MTT法檢測細胞毒作用 BEL-7402細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24h后加入不同濃度的C-1027，并設對照孔和調(diào)零孔，每組至少3個平行孔。48h后，每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液，37℃、5%CO2孵育4h。吸棄上清液，每孔加入200μL DMSO，震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標儀測量570nm 的吸光度(A)。實驗重復3次以上。細胞存活率(%)=(加藥組細胞A值-本底A值)/(對照組細胞A值-本底組細胞A值)×100%。

1.3臺盼藍染色實驗 BEL-7402細胞接種于6孔培板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后加入不同濃度的C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)孵育48h，胰蛋白酶消化細胞，DMEM培養(yǎng)基重懸，加入0.5%臺盼藍染液，染色后倒置顯微鏡下觀察，計數(shù)總細胞數(shù)和染色細胞數(shù)，計算各濃度C-1027對BEL-7402細胞的抑制率。細胞抑制率(%)=死細胞數(shù)/(或細胞數(shù)+死細胞數(shù))×100%。

1.4細胞克隆形成實驗 BEL-7402細胞以500個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。加入不同濃度的C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)孵育48h，之后用新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3天觀察細胞狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)液。直至每個培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)50個以上克隆即終止試驗。4%多聚甲醛常溫固定，Giemsa溶液染色，顯微鏡觀察，記錄含有50個細胞以上的克隆個數(shù)。

1.5細胞自噬檢測 BEL-7402細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，24h后加入不同濃度C-1027(0nM，0.01nM，0.10nM，1nM)處理48h。用移液槍吸走培養(yǎng)基，PBS清洗細胞2次，每孔加入1mL AO工作液，避光染色30min，用PBS清洗去除多余的AO染液，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1C-1027對BEL-7402細胞活力的影響 采用MTT法測定C-1027對肝癌BEL-7402細胞活力的影響。將稀釋至不同濃度的C-1027處理肝癌細胞BEL-7402 48h。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，C-1027以劑量依賴性的方式降低BEL-7402細胞的活力，誘發(fā)了人肝癌細胞的死亡，C-1027處理組細胞的存活率明顯降低，見圖1。統(tǒng)計分析顯示，C-1027對人肝癌BEL-7402細胞的IC50為0.405±0.029nM。

圖1 C-1027對BEL-7402細胞細胞活力的影響

2.2C-1027對BEL-7402細胞生存能力的影響 臺盼藍排斥實驗檢測細胞存活率，臺盼藍將死細胞染成藍色，活細胞不染色。C-1027以劑量依賴性降低BEL-7402細胞的存活率，抑制率如表1所示。

表1 不同濃度C-1027對BEL-7402細胞抑制率作用

2.3C-1027對BEL-7402細胞增殖的影響 為進一步確定C-1027可以抑制肝癌細胞存活的能力，進行了細胞克隆形成實驗，結(jié)果顯示，經(jīng)C-1027處理的BEL-7402細胞的克隆形成數(shù)量明顯少于空白對照組，且隨著C-1027濃度的增加，BEL-7402細胞的克隆形成數(shù)量越來越少，見圖2，克隆數(shù)呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，從結(jié)果可以看出，當C-1027濃度達到0.1nM時顯現(xiàn)出了明顯的抑制作用，而當C-1027濃度達到1nM時，細胞的克隆形成數(shù)量幾乎為零。結(jié)果顯示，C-1027對BEL-7402細胞有顯著的抗增殖作用。

圖2 C-1027對BEL-7402細胞增殖的影響注：***P< 0.001。

2.4C-1027誘導BEL-7402細胞發(fā)生自噬 AO是一種自噬發(fā)生的熒光指示劑，它可以滲入細胞，將DNA和細胞質(zhì)染為亮綠色，因其對pH敏感，AO遇到酸性自噬泡時可以發(fā)出橘紅色熒光，該熒光能在熒光顯微鏡下觀察到。因此，可以用AO標記自噬泡并指示自噬的發(fā)生。結(jié)果顯示，C-1027劑量依賴性觸發(fā)了BEL-7402細胞自噬空泡細胞的積累。 BEL-7402細胞在不同濃度C-1027(0nM、0.01nM、0.10nM、1nM)處理后，AO對細胞染色，可以清楚觀察到?jīng)]有加入C-1027的空白對照組基本看不到橘紅色熒光的存在，隨著C-1027劑量的加大，BEL-7402呈現(xiàn)橘紅色熒光細胞的數(shù)量越來越多，見圖3。此外，橘紅色熒光強度也不斷加強，提示C-1027誘導BEL-7402細胞內(nèi)出現(xiàn)自噬泡，自噬被激活。

圖3 C-1027誘導BEL-7402細胞發(fā)生自噬(100×)注：A：對照組；B：0.01nM C-1027；C：0.1nM C-1027；D：1nM C-1027

3 討論

原發(fā)性肝癌是2020年全球第六大最常被診斷的癌癥和第三大癌癥死因，約有906000例新發(fā)病例和830000例死亡病例[1]。肝細胞癌是一種常見的惡性腫瘤，通常在慢性肝病的背景下出現(xiàn)。肝細胞癌的常見風險因素是慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染，慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染和酒精濫用。在現(xiàn)代治療方法中，晚期肝細胞癌患者幾乎沒有治療選擇，并且預后很差。肝癌的臨床表現(xiàn)取決于診斷階段和肝功能狀態(tài)。盡管肝癌的監(jiān)測程序相比以前完善了很多，但患者總體5年凈生存率仍然很低[7]，確定新的靶點和新的候選治療方案設計抗腫瘤藥物對肝癌的治療非常關(guān)鍵。

與其它類型的抗癌藥物相比，C-1027對多種腫瘤細胞具有極強的殺傷作用，具有高活性特點。此外，C-1027 還有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[8]。這些研究表明，C-1027可能通過胞內(nèi)多種信號通路途徑對腫瘤細胞產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，C-1027能夠顯著降低BEL-7402細胞的活力，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。同時，通過克隆形成實驗證明了C-1027對BEL-7402細胞的抗增殖作用。C-1027處理BEL-7402細胞后，酸性自噬泡數(shù)量增加，提示自噬泡的產(chǎn)生。證明C-1027誘導肝癌細胞發(fā)生自噬。其潛在的分子機制有待進一步研究。

自噬是一個基本的細胞過程，過量或錯誤折疊的蛋白及受損的細胞內(nèi)細胞器被雙膜自噬酶體吞噬，隨后在自溶酶體中降解[9]。自噬的作用是復雜的，因器官和器官而異。肝臟和肌肉等器官需要通過自噬作用來去除過多的脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)積累和線粒體的損傷，以防止產(chǎn)生過量的ROS而導致氧化應激[10]。自噬病中的缺陷與人類疾病的幾種發(fā)病機制有關(guān)，包括神經(jīng)退行性疾病[11]、心血管疾病[12]和癌癥[13]。已證明自噬失調(diào)在肝病，如酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝腫大、肝癌病和原發(fā)性肝臟惡性腫瘤中發(fā)揮作用[14-16]。最近發(fā)現(xiàn)的自噬與腫瘤進展和藥物反應之間的聯(lián)系強調(diào)了自噬在癌癥治療中的重要性[17-18]。目前研究表明，自噬根據(jù)不同的細胞環(huán)境在肝癌生存中發(fā)揮重要作用，探討自噬與肝癌的關(guān)系可能為肝癌帶來新的治療策略。