尹 秦，潘 虹，丁小娟，秦曉光，郭小榮

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州730020

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致的骨質(zhì)變化、骨脆性增加，從而極易引發(fā)骨折的全身代謝性疾病［1］。研究表明，OP的發(fā)生是免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果［2-3］?；谥嗅t(yī)學(xué)“腎主骨”“脾主運(yùn)化”理論，OP與脾腎之氣的強(qiáng)弱密切相關(guān)，脾胃健旺，則腎精氣充足，骨骼強(qiáng)盛。研究表明，針刺能夠改善骨微結(jié)構(gòu)，促進(jìn)成骨細(xì)胞生成［4］，針刺腎俞穴、三陰交穴、關(guān)元穴及足三里穴可培腎壯骨，固精培元［5-8］，這對骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響，但相關(guān)機(jī)制并不明確。RANKL／OPG信號通路是由核因子Kappa B受體活化因子配體（receptor of activator nuclear factor-kB ligand，RANKL）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）構(gòu)成。RANKL／OPG信號通路對破骨細(xì)胞的形成、分化和吸收具有一定的調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制并未完全闡明［9-10］。因此，本研究通過切除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法建立OP大鼠模型，給予電針刺激腎俞穴、三陰交穴、關(guān)元穴、足三里穴，旨在探究針刺對去卵巢大鼠RANKL／OPG信號通路的作用，并分析其對骨代謝平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性Wistar大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量（180±20）g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK（甘）2019-0001，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)造模。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2019010），實(shí)驗(yàn)過程及操作均遵守國家健康與醫(yī)學(xué)研究委員會動物道德準(zhǔn)則。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

無菌針灸針（北京漢醫(yī)醫(yī)療器械有限責(zé)任公司，規(guī)格：0.20 mm×25 mm）；HANS-200A電針儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，規(guī)格：1 mg×21片，批號：H20160679）；RANKL抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0747R-1）；OPG抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0431R-1）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司）；實(shí)驗(yàn)動物微型CT影像系統(tǒng)（德國西門子公司，型號：Inveon）；倒置相差熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；骨密度儀（韓國Osteosys公司，型號：EXA-PRESTO）；骨特異性堿性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BALP）ELISA檢測試劑盒、核結(jié)合因子-α1（core-binding factor α1，CBF-α1）ELISA檢測試劑盒、Ⅰ型膠原羧基末端肽（cterminal typeⅠcollagen telopeptide，CTX-I）ELISA檢測 試劑盒、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen typeⅠamino-terminal peptide，PINP）ELISA檢 測 試 劑 盒、骨鈣素（osteocalcin，OC）ELISA檢測試劑盒均購自北京方程生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物分組與模型制備60只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分空白組、模型組、雌二醇組及針刺組，每組15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，除空白組外，其他大鼠均去除卵巢，建立OP型大鼠［11］，造模組大鼠骨密度較空白組顯著降低時即造模成功［12］。

1.3.2 干預(yù)方法 造模后進(jìn)行為期12周的干預(yù)，參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進(jìn)行換算?？瞻捉M、模型組大鼠給予0.9% NaCl溶液50 μg／（kg·d）灌胃，雌二醇組給予戊酸雌二醇50 μg／（kg·d）灌胃，針刺組采用自制鼠袋固定大鼠，暴露針刺穴位，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》取穴方法選擇腎俞穴、三陰交穴、關(guān)元穴、足三里穴［13］，將針灸針刺入穴位后，接電針儀，疏密波，刺激強(qiáng)度2 mA，頻率2 Hz，15 min／次，1次／d，共治療12周。4組大鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，生長環(huán)境及飼養(yǎng)條件相同。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 骨代謝標(biāo)志物含量測定 經(jīng)腹腔麻醉后處死大鼠，心臟取血2 mL，置于離心機(jī)中，離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r／min，離心10 min，取上清液，ELISA法檢測血清中BALP、CTX-Ⅰ、CBF-α1、PINP、OC含量水平。

1.4.2 骨密度及骨小梁微結(jié)構(gòu)測定 分離4組大鼠右側(cè)股骨標(biāo)本，置于Micro-CT下對遠(yuǎn)端干骺端進(jìn)行掃描，設(shè)定掃描參數(shù)為：65 kV，384 mA，分辨率18 μm。所有標(biāo)本從股骨遠(yuǎn)端生長板頂點(diǎn)至皮質(zhì)部分去掉后為本次掃描興趣區(qū)域（region of interest，ROI），提取圖像資料，自帶骨骼分析軟件（Advanced Bone Analysis，ABA）測定骨組織相關(guān)計量學(xué)指標(biāo)，包括：骨密度（bone mineral density，BMD）、相對骨體積（relative bone volume，BV／TV）、骨小梁厚度（trabecular bone thcikness，Tb.Th）、連接密度（connectivity density，Conn.D）、骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨小梁數(shù)量（trabecular number，Tb.N）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（structure model index，SMI）。所有CT操作、圖像構(gòu)建及統(tǒng)計分析均由同一組研究人員操作完成。

1.4.3 TUNEL法檢測股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況 取4組大鼠股骨組織剪碎后置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)浸泡24 h，不同濃度乙醇按順序脫水后，進(jìn)行切片操作，脫蠟后將標(biāo)本置于蘇木精中進(jìn)行染色15 min，最后脫水透明10 min，TUNEL試劑盒檢測4組大鼠切片標(biāo)本中細(xì)胞凋亡情況，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4.4 RT-PCR法檢測RANKL／OPG mRNA表達(dá)提取4組大鼠下丘腦及股骨部分組織，使用RNA抽提試劑盒提取不同組大鼠股骨組織中總RNA，檢測RNA純度含量后用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物序列，RT-PCR法檢測4組大鼠不同組織中OPG和RANKL mRNA表達(dá)量，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參對照，采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.4.5 免疫印跡法檢測RANKL／OPG蛋白表達(dá) 大鼠處死后，迅速取下丘腦及股骨遠(yuǎn)端的部分組織剪碎，加入RIPA裂解緩沖液放置在冰上30 min，分別提取4組大鼠相應(yīng)組織中的總蛋白，然后使用BCA蛋白測定試劑盒測定各組大鼠皮膚中蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)用SDS-PAGE進(jìn)行等量分離，然后移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PDVF）膜上，并置于4℃下添加一抗（1∶500）孵育過夜。洗滌后添加辣根過氧化物酶綴合的二抗（1∶500），常溫下孵育2 h。使用ECL試劑進(jìn)行顯影，應(yīng)用Quantity One軟件分析蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性時用LSD-t法進(jìn)行檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane's T2進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組干預(yù)后骨密度及骨代謝標(biāo)志物比較

與空白組比較，模型組、雌二醇組、針刺組BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明顯低于空白組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，針 刺 組BMD、BALP、CBF-α1、CTX-I、PINP、OC均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 4組干預(yù)后BMD及骨代謝標(biāo)志物含量比較（±s）Table 2 Comparison of BMD and bone metabolic markers in four groups after intervention（±s）

表2 4組干預(yù)后BMD及骨代謝標(biāo)志物含量比較（±s）Table 2 Comparison of BMD and bone metabolic markers in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.2 4組干預(yù)后骨小梁微結(jié)構(gòu)比較

與空白組比較，模型組BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均明顯降低，Tb.Sp、SMI均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，雌二醇組針 刺組BV／TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均 明 顯 升高，Tb.Sp、SMI均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 4組干預(yù)后骨小梁微結(jié)構(gòu)比較（±s）Table 3 Comparison of trabecular microstructure in four groups after intervention（±s）

表3 4組干預(yù)后骨小梁微結(jié)構(gòu)比較（±s）Table 3 Comparison of trabecular microstructure in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.3 4組股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色提示藍(lán)色熒光為正常細(xì)胞核，綠色熒光為凋亡細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，空白組大鼠骨組織正常，綠色熒光極少；與空白組比較，模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加；與模型組比較，雌二醇組、針刺組干預(yù)后大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯減少。見圖1。

圖1 4組大鼠股骨遠(yuǎn)端細(xì)胞凋亡情況比較（×40）Figure 1 Comparison of apoptosis in distal femur in four groups（×40）

2.4 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達(dá)量比較

與空白組比較，模型組下丘腦、股骨中OPG mRNA均明顯降低，RANKL mRNA均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組下丘腦、股骨中OPG mRNA均明顯上升，RANKL mRNA均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of OPG and RANKL mRNA expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

表4 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of OPG and RANKL mRNA expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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2.5 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)量比較

與空白組比較，模型組下丘腦及股骨組織中OPG蛋白表達(dá)均明顯降低，RANKL蛋白均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組下丘腦、股骨中OPG蛋白表達(dá)均明顯上升，RANKL蛋白表達(dá)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 4組干預(yù)后下丘腦和股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)量比較Figure 2 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention

表5 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)量比較（±s）Table 5 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

表5 4組干預(yù)后下丘腦及股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達(dá)量比較（±s）Table 5 Comparison of OPG and RANKL protein expression in hypothalamus and femur in four groups after intervention（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Note:Compared with the blank group,1)P＜0.05;Compared with the model group,2)P＜0.05.

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3 討 論

研究顯示，OP發(fā)病與骨組織代謝異常、骨微循環(huán)障礙以及基因多態(tài)性等多因素有關(guān)［14］。隨著人口老齡化加快和激素的過多使用，OP患病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢［15］。中醫(yī)學(xué)將OP歸于“骨痿”“骨枯”范疇，辨證論治多從腎、脾等臟腑入手。張景岳［16］指出：“水谷之海先天為之主，精血之海后天為之資……先天不足者，后天培養(yǎng)之，亦可居其強(qiáng)半?！闭f明腎精氣充足與脾胃功能密切相關(guān)，脾胃健旺，則水谷精微化源充盛，骨骼強(qiáng)盛。

中醫(yī)藏象學(xué)說認(rèn)為“腎精生髓，髓通于腦”“諸髓者，皆屬于腦”?？梢姽糯t(yī)家早已認(rèn)識到腦、腎、骨三者密切的聯(lián)系。故當(dāng)腦生理活動異常時，腎主骨生髓之功能也可能異常，甚至可發(fā)展至骨痿。有研究認(rèn)為，OP是由神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致的骨代謝異常［17］，而下丘腦是系統(tǒng)調(diào)節(jié)的主要調(diào)控中心［18］?！澳I藏精”在整體層次的主要體現(xiàn)就是對下丘腦的調(diào)控作用［19］。隨著個體衰老，機(jī)體脾腎漸衰，從而出現(xiàn)“脾腎虧虛”的各種表現(xiàn)，進(jìn)而導(dǎo)致OP發(fā)生發(fā)展［20］。因此，臨床亟需尋找有效的方法干預(yù)OP，并探討其可能的作用機(jī)制。

3.1 針刺可改善OP模型大鼠骨密度，調(diào)節(jié)骨代謝水平

骨密度是臨床檢測骨質(zhì)疏松變化的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠的BMD及骨代謝標(biāo)志物等含量明顯降低，這表明去卵巢大鼠造模后骨量出現(xiàn)丟失，這與骨質(zhì)疏松的病理表現(xiàn)相符。與模型組比較，針刺組大鼠骨密度含量明顯增加，骨代謝相關(guān)標(biāo)志物水平明顯改善，骨小梁微結(jié)構(gòu)指標(biāo)明顯改善，這提示針刺可改善OP模型大鼠骨密度，調(diào)節(jié)骨代謝水平。這與喬梁等［21-22］研究結(jié)果一致。PINP作為Ⅰ型前膠原細(xì)胞外分泌產(chǎn)物是骨形成的敏感指標(biāo)，CTX-Ⅰ是骨吸收過程中Ⅰ型膠原釋放入血的產(chǎn)物。PINP、CTX-Ⅰ是診斷骨質(zhì)疏松癥的特異性指標(biāo)［23-24］。針刺足三里、三陰交、腎俞、關(guān)元等穴位可使血液中PINP及CTX-Ⅰ含量明顯增加，從而提高Ⅰ型膠原的合成速率，促進(jìn)成骨細(xì)胞活動和骨吸收。CBF-α1屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族的轉(zhuǎn)錄因子，由成骨細(xì)胞特異性表達(dá)，是決定成骨細(xì)胞分化的重要因子。OC主要由成骨細(xì)胞、成牙質(zhì)細(xì)胞合成，作為成骨細(xì)胞分泌的特殊非膠原蛋白，其含量變化可用于監(jiān)測骨發(fā)育以及骨代謝情況，在調(diào)節(jié)骨鈣代謝中起重要作用［25］。針刺足三里、三陰交、腎俞、關(guān)元等穴位可提高CBF-α1和OC含量，這有助于調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，調(diào)控骨細(xì)胞的功能因子表達(dá)，促進(jìn)骨骼形成和發(fā)育［26］。

3.2 針刺調(diào)節(jié)OP模型大鼠骨代謝平衡可能與RANKL／OPG信號通路調(diào)控有關(guān)

下丘腦在骨代謝的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，而RANKL／OPG信號通路是骨代謝過程中重要的信號通路之一。本研究結(jié)果顯示，OP模型大鼠下丘腦及股骨遠(yuǎn)端組織中OPG表達(dá)下降，而RANKL表達(dá)升高，這提示下丘腦可協(xié)同調(diào)控股骨組織中RANKL／OPG信號通路表達(dá)，間接促進(jìn)骨吸收過程。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，大鼠造模后RANKL／OPG蛋白和mRNA在下丘腦及股骨遠(yuǎn)端組織中表達(dá)含量發(fā)生明顯變化，但經(jīng)針刺干預(yù)后，OP大鼠下丘腦及股骨組織中OPG mRNA和蛋白表達(dá)量明顯上升，RANKL mRNA和蛋白表達(dá)量明顯下降，這提示針刺能夠調(diào)節(jié)OP大鼠RANKL／OPG信號通路的表達(dá)，這與魏振樸等［27-28］研究結(jié)果一致。維持RANKL／OPG信號通路平衡，能夠調(diào)控破骨細(xì)胞的生成，控制骨代謝，而在骨代謝過程中下丘腦能夠分泌多種信號因子來調(diào)節(jié)骨吸收標(biāo)志物并參與骨重建的過程，骨堿性磷酸酶（BALP）是其中主要的成骨細(xì)胞表型標(biāo)志物之一［29-30］。BALP可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌RANKL轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，促使組織中的核因子κB（NF-κB）受體活化因子配基調(diào)控骨吸收［31］。OPG是由成骨細(xì)胞分泌的RANKL餌受體（NF-κB受體活化因子配體），RANK是RANKL的唯一受體，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、成熟的破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞上均有表達(dá)［32］。在BALP影響下，OPG與RANK競爭并結(jié)合RANKL，拮抗RANKL-RANK表面相關(guān)蛋白的結(jié)合，從而導(dǎo)致破骨細(xì)胞的分化、成熟能力降低，促使破骨細(xì)胞凋亡，抑制骨吸收［33］。針刺足三里、三陰交、腎 俞、關(guān)元等穴位可提高BALP含量，促進(jìn)RANKL／OPG信號通路表達(dá)，促進(jìn)骨吸收作用，增強(qiáng)骨小梁結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，提高骨密度，從而改善骨微結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響骨質(zhì)疏松發(fā)病進(jìn)程［34］。

4 小 結(jié)

針刺腎俞、三陰交、關(guān)元、足三里等穴位能夠改善OP模型大鼠骨代謝標(biāo)志物表達(dá)，調(diào)控骨代謝平衡，其機(jī)制可能與針刺調(diào)控RANKL／OPG信號通路表達(dá)有關(guān)。