朱 清，邵 帥，胡 楠，陳 艷*

1廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州510260；

2荊門市第二人民醫(yī)院，湖北 荊門448000

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿且進行性進展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。有研究顯示，早在β-淀粉樣蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）沉積之前，AD患者腦內(nèi)已存在膽堿能神經(jīng)元受損和基底前腦膽堿能神經(jīng)元的損傷，導致支配海馬和皮層膽堿能纖維減少，這是引起AD患者認知功能減退最重要的原因［1］。研究表明，神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）移植可通過不同的機制改善AD模型鼠的認知功能。但是，外源性NSC移植到腦內(nèi)的存活率及其分化命運無法掌控。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，其可影響體內(nèi)外正常NSC甚至AD腦內(nèi)異常NSC的存活、增殖和分化［2］，并在膽堿能神經(jīng)元表型的維持上發(fā)揮不可替代的作用［3］。但NGF作為一種大分子蛋白質，無法透過血腦屏障，半衰期短，其在腦內(nèi)的應用具有一定局限性。本課題組前期研究結果顯示，聯(lián)合NGF納米粒移植可促進移植NSC存活，增加海馬突觸素（synaptophysin，SYP）的表達，最終改善AD小鼠的認知功能［4］。本研究采用復乳化溶劑擴散法制備NGF納米粒，改變NGF的膜轉運機制，使其可以透過血腦屏障，通過NGF納米粒聯(lián)合NSC移植治療APP／PS1轉基因AD小鼠，觀察移植細胞的存活和分化，探討NSC移植對基底前腦膽堿能神經(jīng)元及海馬、皮層Aβ斑塊的影響，為分析細胞移植治療AD小鼠認知功能障礙可能的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5月齡SPF級雄性APP／PS1轉基因AD小鼠45只，體質量25～35 g，購自廣東省實驗動物中心及南京生物醫(yī)藥研究所［許可證號：SCXK（粵）2013-0002；SCXK（蘇）2015-0001］。購買后用普通飼料飼養(yǎng)至12月齡，飼養(yǎng)過程中因疾病等原因淘汰9只，最終納入36只。5月齡SPF級雄性野生型小鼠（wild type，WT）16只，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心［許可證號SCXK（粵）2013-0034］，飼養(yǎng)至12月齡，選12只納入本研究。廣泛表達增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）C57BL／6-轉基因雌性小鼠3只，購自南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院［許可證號：SCXK（蘇）2015-0001］，購回后交配育種，取孕12.5～14.5 d的胎鼠腦提取NSC。

1.2 實驗試劑

杜氏改良培養(yǎng)基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM／F12）、B27添加劑、神經(jīng)基礎培養(yǎng)基（Neurobasal）（美國Gibco公司）；青-鏈霉素溶液（美國Sigma公司）；堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、NGF（美國PeproTech公司）；硫磺素T試劑（美國Sigma公司）；RT-PCR反轉錄試劑盒、SYBR熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）；鼠抗膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）一抗（Affinity Biosciences公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的二抗（博奧森生物科技公司）；鼠抗β-tubulinⅢ一抗、鼠抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、鼠ChAT抗體（Abcam公司）；兔抗雙腎上腺皮質激素（doublecortin，DCX）抗體（Cell Signaling Technology公司）；羊抗小鼠Alexa FluorTM568、驢抗兔Alexa FluorTM594（Thermo Fisher公司）。所用引物由Invitrogen公司合成，引物序列為：①βactin：上游5'-GTTACAGGAAGTCCCTCACCC-3'，下游3'-CAGAAGCAATGCTGTCACCTT-5'。②Lhx8：上游5'-ACACGAGCTGCTACATTAAGGA-3'，下游3'-CCAGTCAGTCGAGTGGATGTG-5'。③ChAT：上游5'-GGCCATTGTGAAGCGGTTTG-3'，下游3'-GC CAGGCGGTTGTTTAGATACA-5'。

1.3 實驗動物分組

36只12月齡雄性APP／PS1轉基因小鼠采用隨機數(shù)字表法分為AD對照組、NSC移植組、NSC聯(lián)合NGF納米粒移植組（聯(lián)合移植組），每組12只。另外選取12只12月齡雄性野生型小鼠作為WT對照組。

1.4 實驗方法

1.4.1 NSC分離及培養(yǎng)

1.4.1.1 NSC分離 孕12.5～14.5 d的EGFP轉基因小鼠麻醉后斷頸處死，取出Y型子宮轉到無菌環(huán)境，依次放置于75%酒精、D-Hanks平衡鹽中清洗2次，隨即于預冷的平衡鹽液中剝出胎鼠大腦，小心剝離腦膜及血管（冰上操作），將剝離干凈的腦組織轉入另一預冷DMEM／F12培養(yǎng)液中，剪碎并吹打，經(jīng)200目無菌濾網(wǎng)過濾后離心5 min，收集細胞（1 000 r／min）。

1.4.1.2 NSC培養(yǎng)DMEM／F12培養(yǎng)液清洗收集細胞，離心后去除上清，加入新鮮配制的神經(jīng)干細胞增殖培養(yǎng)基（DMEM／F12基礎培養(yǎng)液＋2% B27＋20 ng／mL EGF＋20 ng／mL bFGF＋1%青鏈霉素），吹打混勻計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×105／mL，接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀態(tài)2～3 d半量換液，5～6 d傳代，據(jù)傳代次數(shù)依次記為P1、P2代。

1.4.2 NSC移植 根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜，確定雙側海馬注射點并做標記：前囟后2.05 mm，旁開1.85 mm，深度2.5 mm。具體移植步驟如下：WT對照組和AD對照組小鼠于雙側海馬注射5 μL無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），NSC移植組注射5 μL NSC懸液（PBS制備1×105／μL NSC細胞懸液），聯(lián)合移植組注射5 μL NSC和NGF納米粒懸液（50 ng／mL的NGF納米粒溶液重懸，配制1×105／μL NSC懸液）［5］。移植術后，各組小鼠單籠飼養(yǎng)，自由進食飲水。

1.5 樣本采集

1.5.1 腦切片采集 移植術后4周，每組隨機取6只小鼠灌注取腦行組織切片染色。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，并固定四肢，充分暴露心臟，快速灌注預冷的0.9% NaCl溶液，再灌注預冷的4%多聚甲醛，斷頭取腦，將腦組織置于4%的多聚甲醛中后固定（4℃，16 h），之后分別在10%、20%、30%的蔗糖溶液中進行梯度脫水，脫水完全的腦組織用OCT包埋劑包埋并快速冰凍后切片，片厚30 μm，放入組織凍存液中保存，用于免疫熒光及硫磺素染色。

1.5.2 腦組織采集 移植術后4周，每組隨機取6只小鼠，頸椎脫臼法快速處死小鼠，取腦，分離出雙側基底前腦，一側置于含Trizol的EP管中，用于RNA檢測；另一側置于蛋白裂解液中（-80℃保存），用于蛋白表達的檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 免疫熒光法檢測NSC存活、遷移、分化及基底前腦ChAT水平 選取海馬及基底前腦部位腦組織切片，PBS洗3次（5 min／次），0.3% Triton-X100室溫孵育15 min后用PBS洗3次（5 min／次）；5%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）室溫封閉2 h，吸棄BSA封閉液后，海馬腦切片中加入GFAP、DCX一抗工作液，基底前腦部位切片加入ChAT一抗工作液，4℃孵育過夜（約14 h），次日取出，用PBS徹底洗凈抗體后，加入相對應熒光二抗工作液，室溫孵育1.5 h，避光處理，PBS洗3次（10 min／次）后將腦片平鋪在載玻片上，滴加抗熒光衰減封片劑［含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）］，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6.2 實時熒光定量PCR法檢測基底前腦ChAT和LIM同源盒基因8 mRNA表達 采用Trizol法提取腦組織RNA，并采用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）測各組基底前腦ChAT和LIM同源盒基因8(LIM homeobox8,Lhx8)mRNA濃度。

1.6.2.1 RNA逆轉錄為cDNA①反應體系如下：5×Prime Script Buffer 4 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT Prime 1 μL，Random 6 mers 1 μL、RNA 1 μg，RNase Free H2O up to 20 μL。②反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min，完成后置于-80℃保存。

1.6.2.2 實時熒光定量PCR①反應體系如下：SYBR Premix Ex TaqⅡ10 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，共20 μL。②采用ABI7500儀器進行檢測。按以下步驟進行擴增：預變性95℃30 s；95℃5 s、60℃34 s，共40個循環(huán)；95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。以β-actin為內(nèi)參基因，使用比較閾值法分析目的基因ChAT和Lhx8相對表達量。相對表達量（Relative quantity，RQ）的計算公式為：RQ值＝2-△△CT，△△CT＝（CT實驗組目的基因－CT實驗組內(nèi)參基因）－（CT對照組目的基因－CT對照組內(nèi)參基因）。

1.6.3 Western blot法檢測基底前腦ChAT蛋白表達 取出置于-80℃保存的基底前腦組織（含有蛋白裂解液），冰上溶解后提取總蛋白并檢測濃度，將各組蛋白樣品調(diào)成相同的濃度。蛋白經(jīng)高溫變性后檢測各組蛋白含量。①聚丙烯酰胺凝膠電泳：按照配方配制10%分離膠和5%濃縮膠，各組取等量蛋白樣品加入電泳槽中濃縮膠樣本孔內(nèi)，80 V電泳120 min。②轉膜：將蛋白轉印于聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，276 mA恒流，轉膜100 min。③免疫反應：5%脫脂奶粉封閉1～2 h，TBST緩沖液洗膜后加入ChAT抗體工作液，4℃孵育過夜，次日取出洗凈一抗后加入相應的二抗，室溫孵育1 h，洗凈殘留抗體，加入顯影劑后放入GeneGnome成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶。

1.6.4 硫磺素T染色檢測海馬及皮層淀粉樣斑塊數(shù)量 從組織凍存液中挑出海馬及皮層部位腦片，PBS溶液中清洗3次，5 min／次，將腦片平整黏附于玻片上，待干燥后，蘇木素染色5～10 min，自來水沖洗3次，5 min／次；1%硫磺素T染色5～10 min，自來水沖洗15 min；80%乙醇分色數(shù)秒，陰干避光封片。熒光顯微鏡在DAPI激發(fā)光下檢測各組海馬及皮層Aβ斑塊的數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊用校正t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 移植的EGFP陽性NSC在體內(nèi)的存活、遷移及分化情況

移植4周后，NSC移植組和聯(lián)合移植組免疫熒光下均可見移植NSC存活，并向廣泛的腦區(qū)遷移，包括胼胝體遠端、皮層以及海馬深部。聯(lián)合移植組存活細胞更多，且NSC顯示了粗大的突起。見圖1。在海馬齒狀回中，聯(lián)合移植組的NSC有更多類似于成熟顆粒細胞形態(tài)的細胞，2組移植的NSC均可表達陽性GFAP和陽性DCX。見圖2。移植4周后，NSC移植組和聯(lián)合移植組GFAP陽性細胞分化率、DCX陽性細胞分化率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組膠質細胞及神經(jīng)元分化率比較（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

表1 2組膠質細胞及神經(jīng)元分化率比較（±s）%Table 1 Differentiation rates of glial cells and neurons between two groups（±s）%

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圖1 2組移植神經(jīng)干細胞的存活與遷移（×100）Figure 1 Survival and migration of neural stem cells in vivo between two groups（×100）

圖2 2組移植神經(jīng)干細胞分化（×200）Figure 2 Differentiation of neural stem cells in vivo between two groups（×200）

2.2 NSC聯(lián)合NGF納米粒移植治療對APP／PS1轉基因鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元的影響

2.2.1 ChAT神經(jīng)元細胞數(shù)量 結果顯示，NSC移植組及聯(lián)合移植組基底前腦區(qū)均未見到EGFP陽性NSC。與AD對照組比較，NSC移植組及聯(lián)合移植組移植4周后，ChAT神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與WT對照組比較，NSC移植組ChAT神經(jīng)元細胞數(shù)量雖有所增加但仍明顯較低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而聯(lián)合移植組ChAT神經(jīng)元細胞數(shù)量則無明顯區(qū)別，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3、表2。

圖3 4組基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)量（×200）Figure 3 The number of cholinergic neurons in the basal forebrain in four groups（×200）

表2 4組基底前腦ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量比較Table 2 Comparison of the number of ChAT neurons in basal forebrain in four groups

2.2.2 ChAT蛋白水平表達 結果顯示，與AD對照組比較，NSC移植組及聯(lián)合移植組基底前腦ChAT蛋白水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與WT對照組比較，NSC移植組與聯(lián)合移植組基底前腦ChAT蛋白水平明顯降低，而NSC移植組與聯(lián)合移植組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

2.2.3 ChAT基因及其轉錄因子Lhx8基因表達 結果顯示，與AD對照組比較，NSC移植組及聯(lián)合移植組ChAT和Lhx8基因表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。與WT對照組比較，NSC移植組ChAT和Lhx8基因表達雖有所增加但仍明顯低于WT對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與NSC移植組比較，聯(lián)合移植組ChAT和Lhx8基因表達明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 基底前腦ChAT蛋白及ChAT、Lhx8基因表達Figure 4 Expression of ChAT protein and the gene level of ChAT／Lhx8 in the basal forebrain

2.3 NSC聯(lián)合NGF納米粒移植對APP／PS1轉基因鼠海馬及皮層Aβ斑塊的影響

采用硫磺素T染色檢測海馬及皮層Aβ斑塊數(shù)量的變化，結果顯示，WT對照組小鼠腦內(nèi)無Aβ斑塊沉積，而AD轉基因鼠海馬及皮層有大量Aβ斑塊沉積。與AD對照組比較，NSC移植組、聯(lián)合移植組皮層及海馬Aβ斑塊數(shù)量雖有所減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。與NSC移植組比較，聯(lián)合移植組皮層及海馬Aβ斑塊數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 4組海馬及皮層Aβ斑塊數(shù)量比較（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

表3 4組海馬及皮層Aβ斑塊數(shù)量比較（±s）Table 3 Number of Aβ plaques in hippocampus and cortex in four groups（±s）

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圖5 海馬及皮層Aβ斑塊染色數(shù)量比較（×100）Figure 5 Number of Aβ plaques in the hippocampus and cortex（×100）

3 討 論

研究顯示，AD中存在廣泛的膽堿能功能的退化和神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏［6］，甚至早在Aβ沉積之前就可能存在膽堿能功能障礙。NGF在神經(jīng)元存活、分化、成熟以及突觸生長中起重要作用［7-8］，且對基底前腦膽堿能神經(jīng)元表型的維持起著不可替代的作用［9］?；浊澳X作為腦內(nèi)最大的膽堿能神經(jīng)元核團，主要投射區(qū)包括海馬、皮層、杏仁核和嗅球。本研究采用NSC聯(lián)合NGF納米粒移植干預APP／PS1轉基因AD小鼠，觀察移植NSC存活、遷移及分化情況，以及聯(lián)合移植對基底前腦膽堿能神經(jīng)元及Aβ斑塊的影響，探討NSC聯(lián)合NGF納米粒海馬移植是否對基底前腦膽堿能神經(jīng)元起到直接替代或間接保護作用。

3.1 NSC聯(lián)合NGF納米粒移植可促進NSC存活及遷移

本研究結果顯示，與NSC移植組比較，聯(lián)合移植組NSC存活數(shù)量明顯增加，且NSC具有復雜突起形態(tài)。這提示聯(lián)合移植組可能通過NGF納米粒緩慢釋放NGF，發(fā)揮對NSC的保護作用以及促進NSC突起生長。這與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，NSC聯(lián)合NGF納米粒移植可能通過緩慢釋放NGF，提高突觸前蛋白（SYP）蛋白水平，進而改善AD鼠學習記憶功能的結果一致［5］。其可能的機制是NGF可被突觸末端攝取，經(jīng)逆行轉運至胞體，與其功能性受體TrKA結合，促進NSC分化及成熟，促進海馬突觸重建［10］。此外，本研究采用GFAP、DCX分別對膠質細胞及早期神經(jīng)元進行標記，結果顯示NSC移植組和聯(lián)合移植組的分化率差異無統(tǒng)計學意義，但聯(lián)合移植組中NSC有粗大突起及形態(tài)改變。這提示，使移植的細胞分化成目標神經(jīng)元，然后投射到適當?shù)膮^(qū)域，與機體建立功能聯(lián)系是相當困難的，這與MARSH等［11］認為“神經(jīng)替代作用要比預期復雜”的觀點相似。因此，本課題組認為NGF誘導移植NSC在腦內(nèi)定向分化具有挑戰(zhàn)性，NSC移植促進AD小鼠認知功能恢復的作用機制可能與神經(jīng)替代作用無關。

3.2 NSC聯(lián)合NGF納米粒移植增強基底前腦膽堿能功能

有研究顯示，AD中基底前腦膽堿能神經(jīng)元處于受損及萎縮狀態(tài)［11］，NGF對膽堿能神經(jīng)元表型的維持不可缺少，而AD中存在嚴重的神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏。本研究結果顯示，NSC移植組及聯(lián)合移植組基底前腦區(qū)并無EGFP標記的NSC，與AD對照組比較，NSC移植組及聯(lián)合移植組ChAT陽性細胞數(shù)明顯增加，且ChAT蛋白相對表達量也明顯增加。這提示，NSC海馬移植可以間接補充基底前腦膽堿能神經(jīng)元。NSC移植可能通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元，NSC釋放的營養(yǎng)因子經(jīng)逆行轉運，營養(yǎng)神經(jīng)元胞體，間接修復受損的神經(jīng)元，并非細胞的直接替代作用，這與BLURTON-JONES等［12］觀點相似。NSC聯(lián)合NGF納米粒移植可能通過緩慢釋放NGF，NGF既可保護移植的NSC又可被轉運營養(yǎng)神經(jīng)元胞體。此外，NSC移植組及聯(lián)合移植組中ChAT及其轉錄因子Lhx8基因表達均明顯增加，與NSC移植組比較，聯(lián)合移植組增加明顯更多。這提示，NSC聯(lián)合NGF納米粒移植可促進ChAT及Lhx8基因的表達，LIM同源域家族Lhx8基因可作為NGF誘導膽堿能表型維持的調(diào)節(jié)器，這種調(diào)節(jié)與ERK信號通路有關［11，13］。這提示了NGF納米?？赡芡ㄟ^緩釋NGF，調(diào)控Lhx8基因促進ChAT表達，從而保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元。

3.3 NSC聯(lián)合NGF納米粒移植不能減輕AD腦內(nèi)Aβ斑塊沉積

Aβ級聯(lián)假說作為AD經(jīng)典病理假說之一，該假說認為Aβ具有神經(jīng)毒性，可引起神經(jīng)纖維纏結、血管損傷、神經(jīng)元丟失等一系列病理改變［14］。APP／PS1轉基因小鼠是常用的AD動物模型，該雙轉基因小鼠能夠較好地模擬AD的病理和行為學特征，如Aβ斑塊沉積及認知能力下降［15-16］。本研究中采用硫磺素染色檢測移植4周后各組小鼠海馬和皮層Aβ斑塊負荷，結果顯示，12月齡APP／PS1轉基因AD小鼠海馬和皮層存在大量的Aβ斑塊沉積，而NSC移植及聯(lián)合NGF納米粒移植均不能有效減輕Aβ斑塊 沉 積。這 與ZHANG等［17］研 究 認 為 小 鼠 來 源 的NSC移植并不能改善APP／PS1轉基因小鼠Aβ斑塊沉積的結果相似。但也有部分研究認為，使用人來源NSC和人來源的間充質干細胞移植治療AD模型鼠可以顯著減少AD腦內(nèi)的Aβ斑塊沉積［18］，這可能與高級物種來源的干細胞可對低級物種發(fā)揮更大的治療作用有關。本研究尚不能證實NSC移植促進AD小鼠認知功能改善與降低Aβ斑塊沉積有關。

4 小 結

NSC聯(lián)合NGF納米粒移植可以間接保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元，保護NSC的存活和成熟，并促進基底前腦ChAT和Lhx8的基因表達，但其不能減少海馬和皮層中Aβ斑塊沉積。但NSC聯(lián)合NGF納米粒移植保護基底前腦膽堿能神經(jīng)元的具體機制、移植NSC分化的進一步調(diào)控及其參與宿主細胞的功能整合等尚需進一步研究。