劉 沁，段辛威，李西海

1香港大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳518053；

2福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；

3福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種多發(fā)于兒童和青少年的侵襲性原發(fā)性骨惡性腫瘤，其確切病理、生理機(jī)制尚不明確。當(dāng)前臨床主要采用新輔助化療加手術(shù)的方式進(jìn)行治療，患者生存率仍不理想，且尚無有效的系統(tǒng)療法來應(yīng)對(duì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤［1］。尋找新的骨肉瘤干預(yù)藥物是當(dāng)前亟待解決的臨床和科研問題。中醫(yī)藥緩解惡性腫瘤臨床癥狀和放化療增效減毒等方面效果明顯［2］，白花蛇舌草具有清熱利濕和解毒消癰的功效，其各部位及其黃酮類、三萜類、香豆素類和多糖類提取物或制劑可在增殖、侵襲、耐藥等方面對(duì)骨肉瘤發(fā)揮不同的作用［3-5］，但具體作用機(jī)制尚不完全明確。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法研究白花蛇舌草對(duì)骨肉瘤干預(yù)的分子作用機(jī)制，有助于為骨肉瘤臨床用藥及白花蛇舌草的開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 白花蛇舌草活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology data-base and analysisplatform，TCMSP）篩選出與白花蛇舌草相關(guān)的化合物和靶基因，并設(shè)置生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為篩選條件［6］，篩選出有效成分，同時(shí)在該數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出符合要求的成分靶基因，并刪除重復(fù)靶基因，將篩選出的靶基因作為白花蛇舌草的預(yù)測(cè)靶基因。

1.2 骨肉瘤相關(guān)基因及白花蛇舌草治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用GEO-NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GEO Datasets子集，篩選出骨肉瘤相關(guān)基因表達(dá)測(cè)序芯片，選取3個(gè)表達(dá)顯著的芯片GSE28424、GSE19276、GSE16088，利用log 2算法對(duì)基因數(shù)據(jù)整理，篩選出3個(gè)芯片中的差異基因，將3個(gè)芯片中至少同時(shí)存在于2個(gè)及以上芯片的差異基因與Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)、孟德爾OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到的骨肉瘤相關(guān)基因取并集作為骨肉瘤疾病基因數(shù)據(jù)集。

通過Perl語(yǔ)言編輯分析，將白花蛇舌草預(yù)測(cè)的靶基因與骨肉瘤疾病基因取交集，從而得到白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因，通過這部分交集基因構(gòu)建起白花蛇舌草-骨肉瘤的分子機(jī)制層面聯(lián)系。

1.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.1軟件將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因與藥物成分分別導(dǎo)入，將骨肉瘤靶基因、白花蛇舌草主要有效成分進(jìn)行可視化編輯，構(gòu)建白花蛇舌草干預(yù)骨肉瘤活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因?qū)隨TRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將其保存為tsv文件。采用Cytoscape 3.8.1軟件打開文件，在PPI網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上進(jìn)行拓?fù)浞治?，即選取介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method centrality，LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）6種拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析［7］。以各項(xiàng)拓?fù)鋮?shù)值均＞中位數(shù)值作為篩選條件，即可得到關(guān)鍵基因。

1.5 生物信息學(xué)分析

將白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因用基于R語(yǔ)言的、面向基因組信息分析的Bioconductor軟件合集對(duì)白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因進(jìn)行基因本體論（gene onotology，GO）分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。

1.6 分子對(duì)接分析

選擇PPI拓?fù)浞治龊Y選出的核心網(wǎng)絡(luò)上的靶基因及其對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)查找白花蛇舌草活性成分2D構(gòu)象，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117軟件轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)并優(yōu)化最小自由能，使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)查找靶蛋白，導(dǎo)入PyMOL 2.4.1軟件，去除水分子、分離原有配體，然后導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6軟件，使對(duì)接位點(diǎn)選擇以原有配體為中心，設(shè)置網(wǎng)格箱（gird box）為默認(rèn)值，運(yùn)用Vina進(jìn)行分子對(duì)接，獲得白花蛇舌草中活性分子與靶蛋白的對(duì)接結(jié)果，將對(duì)接結(jié)果輸出為txt文件和pdbqt文件，打開txt文件查看對(duì)接結(jié)果，用PyMOL 2.4.1打開查看對(duì)接圖像。一般認(rèn)為當(dāng)結(jié)合親和力（binding affinity）＜-4.25 kcal／mol時(shí)說明活性分子與靶蛋白有一定的結(jié)合活性，結(jié)合親和力＜－5.0 kcal／mol時(shí)有較好的結(jié)合活性，結(jié)合親和力＜－7.0 kcal／mol時(shí)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［7］。

1.7 引用和參考的數(shù)據(jù)庫(kù)

見表1。

表1 參考數(shù)據(jù)庫(kù)Table 1 Collections of database

2 結(jié) 果

2.1 白花蛇舌草中有效活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

根據(jù)篩選條件OB≥30%、DL≥0.18從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出7個(gè)白花蛇舌草有效成分，見表2。7個(gè)有效成分中，2個(gè)成分（MOL001646 2，3-甲氧基-6-甲氧基蒽醌、MOL001663 3-表齊墩果酸）靶基因數(shù)據(jù)缺失，其余5個(gè)成分（MOL001659多孔甾醇、MOL001670 2-甲氧基-3-甲基-9，10蒽醌、MOL 000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇、MOL000098槲皮素）共有靶基因169個(gè)，見表3。

表2 白花蛇舌草主要有效成分Table 2 Main effective components of Hedyotis diffusa

表3 白花蛇舌草靶基因Table 3 Target genes of Hedyotis diffusa

2.2 骨肉瘤相關(guān)基因及共同靶點(diǎn)

骨肉瘤相關(guān)基因篩選如下：GEO-NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)1 376個(gè)、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)1 904個(gè)、孟德爾OMIM數(shù) 據(jù) 庫(kù)4個(gè)、PharmGKB數(shù) 據(jù) 庫(kù)94個(gè)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)2個(gè)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)7個(gè)，刪除重復(fù)值后得到3 178個(gè)骨肉瘤相關(guān)基因，見圖1。將169個(gè)白花蛇舌草靶基因和3 178個(gè)骨肉瘤相關(guān)基因取交集，得到98個(gè)白花蛇舌草-骨肉瘤共同靶基因，這98個(gè)靶基因即為白花蛇舌草治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。

2.3 白花蛇舌草活性成分-骨肉瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.8.1軟件將得到的5個(gè)有效成分和98個(gè)白花蛇舌草-骨肉瘤靶基因構(gòu)建可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中MOL001670可調(diào)控5個(gè)靶基因、MOL000449可調(diào)控10個(gè)靶基因、MOL000098可調(diào)控91個(gè)靶基因、MOL000358可調(diào)控13個(gè)靶基因、MOL001659可調(diào)控2個(gè)靶基因，有16個(gè)靶基因至少被2種及以上有效成分調(diào)控，見圖2。

2.4 共同靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選

將98個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為Homo sapiens，并設(shè)置medium confidence為0.900，去除游離節(jié)點(diǎn)，得到“白花蛇舌草-骨肉瘤”的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng) 絡(luò)由84個(gè) 節(jié) 點(diǎn)（Node）、316條 邊（Edge）構(gòu)成，見圖3。PPI核心網(wǎng)絡(luò)由8個(gè)節(jié)點(diǎn)和51條邊組成，見圖4。篩選出核心基因8個(gè)，分別是雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、JUN、RAC-α絲氨酸／蘇氨酸-蛋白激酶（RAC-alpha serine／threonine-protein kinase，AKT1）、G1／S特 異 性細(xì)胞周期蛋白-D1（G1／S-specific cyclin-D1，CCND1）、FOS、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）、MYC。見表4。

圖4 篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因Figure 4 Screening core genes in the PPI network

2.5 生物信息學(xué)分析

將98個(gè)交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。

2.5.1 GO功能富集分析GO富集分析得到P＜0.05的GO條目共計(jì)2 205條，具體包括以下：①生物進(jìn)程（biological process，BP）結(jié)果2 037條，包括細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控等；②細(xì)胞組分CC（cellular components，CC）結(jié)果39條，包括膜筏、膜微域、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合體、核染色質(zhì)、細(xì)胞周期素-依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物等；③分子功能（molecular function，MF）結(jié)果129條，包括泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性、核受體活性、DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子活性和RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等，各類前10的結(jié)果見圖5。

圖5 GO富集分析結(jié)果圖Figure 5 Results of GO enrichment analysis

2.5.2 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析得到P＜0.05的通路155條，主要富集在包括前列腺癌通路、膀胱癌通路、胰腺癌、小細(xì)胞肺癌、IL-17信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、細(xì)胞衰老等通路上，前30條通路結(jié)果見圖6。

圖6 KEGG富集結(jié)果圖Figure 6 Results of KEGG enrichment

2.6 分子對(duì)接及結(jié)合自由能分析

本 研 究 選 取 核心 靶 點(diǎn)（ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC）和白花蛇舌草的3個(gè)有效成分進(jìn)行分子對(duì)接，以驗(yàn)證白花蛇舌草活性成分與靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，通過結(jié)合自由能判斷分子間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，9組對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能均＜－7 kcal／mol，見表5、圖7。

圖7 分子對(duì)接三維圖Figure 7 Three dimensional view of molecular docking

3 討 論

骨肉瘤在中醫(yī)學(xué)里屬“石癰”“石疽”“石巖”等范疇，其病因病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，正氣虧虛為本，痰濁瘀濕為標(biāo)［8］。先天腎氣虧虛，骨失所養(yǎng)使邪毒趁虛內(nèi)侵于骨、痰瘀內(nèi)生致邪毒閉郁在骨、外感邪毒內(nèi)傷于骨都可導(dǎo)致骨肉瘤發(fā)病［9］。白花蛇舌草有清熱利濕、解毒消癰、祛濕散結(jié)的功效，在國(guó)家名老中醫(yī)抗腫瘤用藥規(guī)律研究中，白花蛇舌草的使用頻次居前5名［10］，如由白花蛇舌草、炙黃芪等組成的清解扶正顆粒在對(duì)大腸癌的臨床治療上療效確切［11］。有研究表明，白花蛇舌草對(duì)骨肉瘤增殖、侵襲、耐藥都有一定干預(yù)作用［4，12］，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探明。

本研究通過對(duì)篩選出的98個(gè)白花蛇舌草-骨肉瘤交集基因進(jìn)行分析，PPI分析得到ESR1、JUN、AKT1、CCND1、FOS、MAPK1、TP53、MYC 8個(gè)度值最高的核心靶點(diǎn)，可能是白花蛇舌草干預(yù)骨肉瘤潛在靶點(diǎn)。GO富集結(jié)果顯示，交集基因BP主要富集在對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、對(duì)類固醇和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）反應(yīng)以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物進(jìn)程上，其中對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的調(diào)控這一生物進(jìn)程富集了包括TP53和AKT1在內(nèi)的25個(gè)基因，LPS就可通過cAMP／PKA通路上調(diào)髓樣樹突狀細(xì)胞中IL23表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展［1］。CC主要富集在膜性結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物和線粒體等細(xì)胞組分上，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物這一細(xì)胞組分上富集了包括JUN、CCND1、FOS、TP53在內(nèi)的15個(gè)基因，JUN與FOS可形成核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子二聚體AP-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，此外，這也可能與線粒體凋亡途徑和膜電位極化有關(guān)；MF主要富集在轉(zhuǎn)錄因子活性上，這與CC富集結(jié)果相一致。KEGG富集結(jié)果顯示，基因主要富集在膀胱癌和小細(xì)胞肺癌等癌癥、p53、鉑基耐藥、細(xì)胞凋亡等通路上，度值排名前3的通路是膀胱癌、前列腺癌和糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE。其中p53信號(hào)途徑的上調(diào)對(duì)骨肉瘤的阿霉素化療具有促凋亡和提高藥物敏感性作用［13］，曲古菌素A通過p53信號(hào)通路的激活以劑量依賴的方式促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞（MG63）細(xì)胞凋亡［14］。

本研究對(duì)2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌、β-谷甾醇、槲皮素3個(gè)化合物的分析發(fā)現(xiàn)，其可能是白花蛇舌草干預(yù)骨肉瘤的主要成分。其中甾醇類（β-谷甾醇）和蒽醌類（2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌）對(duì)骨肉瘤作用機(jī)制未見報(bào)道，但2-甲氧基-3-甲基-9，10-蒽醌的靶點(diǎn)ESR1與β-谷甾醇的靶點(diǎn)JUN都和骨肉瘤密切相關(guān)。槲皮素作為白花蛇舌草中的黃酮類主要成分，對(duì)骨肉瘤的干預(yù)具有多渠道、多靶標(biāo)的作用特點(diǎn)。一方面，通過改變骨肉瘤細(xì)胞周期，將細(xì)胞周期阻抑在S期以抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡。另一方面，通過下調(diào)甲狀旁腺激素受體1（PTHR1）和Bcl-2、上調(diào)miRNA-217和BAX提高骨肉瘤放化療敏感性；還可上調(diào)ROS-NUPR1通路增加自噬通量、促進(jìn)線粒體去極化、改變活性氧濃度來抑制骨肉瘤增殖［15-17］。分子對(duì)接結(jié)果驗(yàn)證了白花蛇舌草核心分子與靶標(biāo)蛋白具有很好的結(jié)合作用。

骨肉瘤的發(fā)生是一個(gè)包含增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)植的多階段多反應(yīng)過程，8個(gè)核心基因都參與了這一過程。其中MAPK、JUN、FOS、CCND1、TP53這5個(gè)蛋白可形成信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)，內(nèi)外源信號(hào)傳遞至MAPK后，MAPK作為一條入核通路上的關(guān)鍵蛋白可將信號(hào)傳遞給核內(nèi)JUN和FOS，如MAPK家族JNK可磷酸化c-JUN［18－19］。①JUN家族蛋白可在家族內(nèi)或與FOS家族蛋白形成二聚體，如c-JUN和c-FOS形成核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子二聚體AP-1［20］，AP-1與具有結(jié)合位點(diǎn)的基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)。②JUN和FOS也參與細(xì)胞周期調(diào)控，兩蛋白家族中不同蛋白對(duì)細(xì)胞周期具有不同的調(diào)節(jié)作用，如c-JUN可激活CCND1對(duì)細(xì)胞周期起到正向調(diào)節(jié)作用，而JUN B則抑制CCND1激酶活性從而延遲G1期。③JUN可調(diào)節(jié)抑癌基因TP53編碼的蛋白p53［21］及其效應(yīng)因子p21從而擾亂細(xì)胞周期［22-24］，而p53異常表達(dá)（如突變等）常與上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化及骨肉瘤和其他腫瘤惡性預(yù)后相關(guān)［25］。因此，從這5個(gè)靶蛋白入手干預(yù)骨肉瘤都取得了良好干預(yù)效果。如micRNA-15a、micRNA-16-1和micRNA-466可靶向下調(diào)CCND1阻抑骨肉瘤細(xì)胞周期［26］，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖；而lncRNA FLVCRAS1則通過靶向下調(diào)miRNA381-3p來增加CCND1表達(dá)，從而促進(jìn)骨肉瘤增殖［27］；三氧化二砷（As2O3）聯(lián)合阿霉素（ADM）可通過MAPK通路抑制微管不穩(wěn)定蛋白介導(dǎo)的骨肉瘤侵襲［28］。此外，MYC、ESR1、AKT1、MAPK1在骨肉瘤組織或細(xì)胞中的表達(dá)高于正常水平，通過micRNA、上下游效應(yīng)因子或抑制劑下調(diào)4個(gè)基因表達(dá)的效應(yīng)水平可降低骨肉瘤侵襲性，阻抑骨肉瘤進(jìn)展［29－34］。ESR則在骨肉瘤及阿霉素耐藥細(xì)胞株中都過表達(dá)，ESRα的高表達(dá)能增加骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性［35］。

4 小 結(jié)

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的角度證實(shí)了白花蛇舌草能通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑對(duì)骨肉瘤進(jìn)行干預(yù)，作用機(jī)制主要體現(xiàn)在干預(yù)骨肉瘤增殖、侵襲和耐藥等方面，為白花蛇舌草在骨肉瘤的臨床使用提供依據(jù)。下一步研究可以通過液-質(zhì)聯(lián)用色譜等方法鑒別白花蛇舌草的活性成分，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出來的關(guān)鍵靶點(diǎn)和反應(yīng)級(jí)聯(lián)，從而為白花蛇舌草在骨肉瘤中的應(yīng)用提供進(jìn)一步依據(jù)。