楊明輝， 劉志勇*， 關(guān)東升， 董 寧， 李 歌， 代 云

(1.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046)

錫葉藤Tetraceraasiatica(Lour.) Hoogland又稱對角刺、酸銅子、對節(jié)刺、刺凍綠，是五椏果科錫葉藤屬植物錫葉藤和毛葉錫葉藤的根[1]，多生長于海拔500～2 100 m的丘陵、灌叢、山地林中，主要分布地域?yàn)槿毡?、朝鮮、越南、印度及中國的河南、湖北、廣東、廣西等地，具有收澀固脫、消腫止痛、固精益智的功效，用于久瀉久痢、尿血便血、遺精遺尿、白帶過多、子宮脫垂、脫肛、跌打腫痛等[2]，其主要化學(xué)成分包括黃酮類、有機(jī)酸類、苯醌類、木脂素類、生物堿類[3]，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、保肝、神經(jīng)保護(hù)，提高免疫力等作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)對錫葉藤95%乙醇提取物進(jìn)行分離，得到13個(gè)化合物，均為首次從該植物中分離得到，其中化合物1～3、7～9、11～13為首次從該屬植物中發(fā)現(xiàn)。再測試所得化合物對神經(jīng)遞質(zhì)(5-羥色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影響，結(jié)果顯示化合物1～2、7、11～12對神經(jīng)遞質(zhì)有不同程度的改善。

1 材料

Triple-T5843型高分辨質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Bruker AV 400型核磁共振波譜儀(TMS內(nèi)標(biāo)，瑞士Bruker公司)；HT1217K型電子天平(瑞士Buchi公司)；Sephadex LH-20(德國Merck公司)；JF2615型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(美國Pharmacia公司)；柱色譜硅膠(100～200、300～400目，青島海洋化工廠)；PK-26型暗箱式紫外分析儀(美國Bio-Rad公司)；神經(jīng)節(jié)苷脂(日本Olypms公司)； CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。提取分離所用溶劑均為分析純。

錫葉藤采自河南省平頂山市，由平頂山學(xué)院夏西超教授鑒定為錫葉藤Tetraceraasiatica(Lour.) Hoogland 的根。

2 提取與分離

取干燥錫葉藤31.5 kg，加入95%乙醇回流提取3次(2、2、1 h)，合并提取液，減壓回收溶劑，得錫葉藤浸膏3.8 kg。將上述浸膏超聲溶于水中，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得石油醚萃取物(163.2 g，F(xiàn)r.A)、二氯甲烷萃取物(116.3 g，F(xiàn)r.B)、乙酸乙酯萃取物(115.6 g，F(xiàn)r.C)、正丁醇萃取物(124.5 g，F(xiàn)r.D)。取Fr.B，采用硅膠柱分離，以石油醚-丙酮(100∶0～0∶100)梯度洗脫，合并相似組分，得到9個(gè)組分(Fr.B1～Fr.B9)。取Fr.B3，采用硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20～20∶80)梯度洗脫，得到12個(gè)組分(Fr.B3-1～Fr.B3-12)。Fr.B3-5經(jīng)石油醚-丙酮(70∶30)分離，得化合物3(19 mg)、7(27 mg)；Fr.B3-7經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶，得化合物1(26 mg)；Fr.B3-9經(jīng)Sephadex LH-20分離，以甲醇洗脫，得化合物4(24 mg)。取Fr.C，采用硅膠柱色譜分離，以石油醚-二氯甲烷(80∶20～20∶80)梯度洗脫，合并得到11個(gè)組分(Fr.C1～Fr.C11)。Fr.C2經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯(70∶30～30∶70)梯度洗脫，得到10個(gè)組分(Fr.C2-1～Fr.C2-10)。Fr.C2-4經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-丙酮(50∶50)洗脫，得化合物2(22 mg)、9(27 mg)；Fr.C2-6經(jīng)Sephadex LH-20分離，以甲醇洗脫，得化合物5(34 mg)；Fr.C2-8經(jīng)硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯(40∶60)洗脫，得化合物6(32 mg)、11(18 mg)。取Fr.C5，采用硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(60∶40～40∶60)梯度洗脫，得到8個(gè)組分(Fr.C5-1～Fr.C5-8)。Fr.C5-3以石油醚-丙酮(50∶50)分離，得化合物8(28 mg)、13(23 mg)；Fr.C5-5經(jīng)Sephadex LH-20分離，以甲醇洗脫，得化合物12(34 mg)。取Fr.D，采用硅膠柱分離，以二氯甲烷-正丁醇(90∶10～10∶90)梯度洗脫，合并相似成分，得到8個(gè)組分(Fr.D1～Fr.D8)。取Fr.D3，采用硅膠柱色譜分離，以丙酮-正丁醇(60∶40～40∶60)梯度洗脫，得到7個(gè)組分(Fr.D3-1～Fr.D3-7)。Fr.D3-5經(jīng)硅膠柱分離，以乙酸乙酯-正丁醇(50∶50)洗脫，得化合物10(26 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 356.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.81 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2)，6.49 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1)，4.39 (1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，4.31 (1H，d，J=8.2 Hz，H-7)，3.96 (1H， m，H-6)，3.79 (3H，s，3-OCH3)，3.70 (3H，s，8-OCH3)，3.09 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，Ha-10)，3.05～2.83 (2H，m，Ha-5，Hb-10)，2.69 (1H，td，J=12.0，8.2 Hz，Ha-16)，2.71～2.56 (1H，m，Hb-16)，2.24(1H，d，J=12.0 Hz，Hb-5)，2.06 (1H，d，J=8.2 Hz，Ha-15)，1.92 (1H，td，J=8.2，2.2 Hz，Hb-15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 120.4 (C-1)，109.8 (C-2)，148.2 (C-3)，147.3 (C-4)，36.8 (C-5)，69.2 (C-6)，67.3 (C-7)，147.2 (C-8)，47.3 (C-9)，37.2 (C-10)，130.6 (C-11)，124.1 (C-12)，40.3 (C-13)，129.4 (C-14)，39.2 (C-15)，40.8 (C-16)，56.9 (3-OCH3)，57.2 (8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為sinococuline。

化合物2：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 484.2[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.51 (1H，d，J=12.0 Hz，H-7?)，6.97 (1H，brs，H-2?)，6.73 (1H，d，J=12.0 Hz，H-6?)，6.54 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5?)，6.37 (2H，brs，H-2，5)，6.29 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-6)，6.09 (1H，d，J=12.0 Hz，H-8?)，4.35 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1′)，4.08 (1H，d，J=12.0 Hz，H-1″)，2.73(2H，m，H-7)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 131.5 (C-1)，118.7 (C-2)，146.2 (C-3)，144.5 (C-4)，117.1 (C-5)，121.3 (C-6)，36.2 (C-7)，69.8 (C-8)，100.3 (C-1′)，70.5(C-2′)，77.4 (C-3′)，66.3 (C-4′)，76.1 (C-5′)，68.2 (C-6′)，104.3 (C-1″)，73.1(C-2″)，76.9 (C-3″)，69.8 (C-4″)，76.4 (C-5″)，60.2 (C-6″)，125.7 (C-1?)，115.3 (C-2?)，146.1 (C-3?)，151.2 (C-4?)，117.5 (C-5?)，122.3 (C-6?)，145.6 (C-7?)，114.1 (C-8?)，167.2 (C-9?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為isolugrandoside。

化合物3：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 273.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.23 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13a)，5.52 (1H，d，J=8.2 Hz，H-13b)，4.19 (1H，m，H-8)，3.91 (1H，t，J=8.2 Hz，H-4)，0.87 (3H，d，J=8.2 Hz，H-14)，0.83 (3H，s，H-15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 44.8 (C-1)，24.7 (C-2)，29.1 (C-3)，84.2 (C-4)，45.1 (C-5)，37.2 (C-6)，48.3 (C-7)，82.1 (C-8)，45.2 (C-9)，29.6 (C-10)，138.4 (C-11)，169.5 (C-12)，120.6 (C-13)，19.8 (C-14)，18.1 (C-15)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為2-desoxy-4-epi-pulchellin。

化合物4：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 175.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 9.72 (1H，s，H-7)，7.41 (2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2，6)，7.04 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，4.03 (3H，s，4-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 128.6 (C-1)，129.1 (C-2)，149.2 (C-3)，159.1 (C-4)，109.2 (C-5)，116.8 (C-6)，55.8 (4-OCH3)，193.1 (7-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為3-羥基對甲氧基苯甲醛。

化合物5：黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 169.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 9.49 (1H，d，J=8.2 Hz，H-9)，7.61 (1H，d，J=12.0 Hz，H-7)，7.19 (1H，d，J=8.2 Hz，H-2)，7.08 (1H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-6)，6.76 (1H，d，J=8.2 Hz，H-5)，6.58 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-8)，3.92 (3H，s，3-OCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 127.3 (C-1)，110.3 (C-2)，149.1 (C-3)，152.7 (C-4)，112.4 (C-5)，126.2 (C-6)，158.1 (C-7)，119.1 (C-8)，55.9 (3-OCH3)，195.7 (9-CHO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10] 基本一致，故鑒定為3-甲氧基對羥基肉桂醛。

化合物6：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 247.2[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 12.65 (1H，s，-OH)，6.41 (1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，5.96 (1H，d，J=12.0 Hz，H-4′)，4.03 (2H，s，2-CH2)，3.82 (3H，s，-OCH3)，2.71 (3H，s，2′-COCH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 169.8 (C-1)，39.7 (C-2)，135.9 (C-1′)，113.8 (C-2′)，159.7 (C-3′)，118.2 (C-4′)，158.1 (C-5′)，109.4 (C-6′)，51.3 (1-OCH3)，31.2 (2′-COCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為2-乙酰基-3，5-二羥基-苯乙酸甲酯。

化合物7：黃色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 339.1[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 11.93 (1H，s，5-OH)，7.12 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2′)，7.05 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5′)，6.91 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-6′)，6.08 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，5.93 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，5.51 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-2)，3.89 (3H，s，7-OCH3)，3.82 (3H，s，4′-OCH3)，3.19 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-3a)，2.82 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-3b)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 103.7 (C-1)，77.2 (C-2)，43.5 (C-3)，198.5 (C-4)，162.3 (C-5)，95.3 (C-6)，166.7 (C-7)，94.1 (C-8)，161.8 (C-9)，103.4 (C-10)，129.4 (C-1′)，112.4 (C-2′)，145.7 (C-3′)，148.2 (C-4′)，113.7 (C-5′)，118.2 (C-6′)，56.3 (4′-OCH3)，57.1 (7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為5，3′-dihydroxy-7，4′-dime-thoxyflavanone。

化合物8：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 201.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 4.72 (1H，d，J=8.2 Hz，H-1′)，4.28 (1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-5′)，3.97 (1H，dq，J=12.0，8.2 Hz，H-2)，3.70 (1H，dq，J=8.2，2.2 Hz，H-1)，3.65 (1H，brd，J=11.3 Hz，H-3)，1.24 (3H，t，J=8.2 Hz，H-4′)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 64.9 (C-1)，16.8 (C-2)，104.9 (C-1′)，74.8 (C-2′)，79.1 (C-3′)，70.8 (C-4′)，66.8 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為ethyl β-D-xylopyranoside。

化合物9：黃白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 469.8[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.23 (2H，d，J=12.0 Hz，H-11，13)，6.98 (2H，d，J=12.0 Hz，H-10，14)，6.74 (1H，s，H-5)，6.58 (1H，s，H-5)，4.82 (1H，d，J=8.2 Hz，H-1′)，3.97 (1H，brs，H-1)，3.93～3.29 (6H，m，H-2′～6′)，3.76 (3H，s，12′-OCH3)，3.24～2.68 (6H，m，H-3，4，15)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 58.3 (C-1)，63.7 (C-2)，42.2 (C-3)，30.1 (C-4)，113.7 (C-5)，149.3 (C-6)，146.2 (C-7)，112.7 (C-8)，134.2 (C-9)，130.3 (C-10)，117.6 (C-11)，157.6 (C-12)，117.3 (C-13)，132.4 (C-14)，41.8 (C-15)，103.1 (C-1′)，74.8 (C-2′)，77.6 (C-3′)，72.2 (C-4′)，77.4 (C-5′)，63.1 (C-6′)，125.6 (C-4a)，129.3 (C-4b)，55.8 (12-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為coclaurine 3-O-β-D-glucoside。

化合物10：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 359.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 3.72 (1H，t，J=8.2 Hz，H-17a)，3.63 (1H，t，J=8.2 Hz，H-17b)，1.18 (3H，s，H-18)，1.09 (3H，s，H-20)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 39.7 (C-1)，18.8 (C-2)，38.2 (C-3)，44.1 (C-4)，57.4 (C-5)，21.8 (C-6)，42.3 (C-7)，45.2 (C-8)，56.3 (C-9)，40.2 (C-10)，19.3 (C-11)，25.4 (C-12)，44.8 (C-13)，36.5 (C-14)，53.4 (C-15)，82.3 (C-16)，66.1 (C-17)，30.2 (C-18)，181.3 (C-19)，16.1 (C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為16α，17-dihydroxy-ent-kaura-19-oic acid。

化合物11：白色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 399.7[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 5.13 (1H，s，H-14)，4.02 (1H，t，J=8.2 Hz，H-15)，3.91 (1H，t，J=8.2 Hz，H-16a)，3.79 (1H，m，H-2)，3.69 (1H，t，J=8.2 Hz，H-16b)，3.57 (1H，d，J=12.0 Hz，H-19a)，3.26 (1H，d，J=12.0 Hz，H-19b)，1.41 (3H，s，H-22)，1.30 (3H，s，H-23)，1.12 (3H，s，H-18)，0.91 (3H，s，H-17)，0.84 (3H，s，H-20)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 48.3 (C-1)，64.7 (C-2)，43.8 (C-3)，40.2 (C-4)，54.8 (C-5)，21.6 (C-6)，35.8 (C-7)，137.2 (C-8)，49.3 (C-9)，39.1 (C-10)，19.6 (C-11)，32.6 (C-12)，36.3 (C-13)，128.3 (C-14)，80.2 (C-15)，64.1 (C-16)，23.2 (C-17)，26.2 (C-18)，65.2 (C-19)，16.9 (C-20)，109.3 (C-21)，25.8 (C-22)，24.7 (C-23)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為isopropylidenkirenol。

化合物12：黃色粉末(甲醇)。ESI-MSm/z: 504.9[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ: 7.23 (1H，brs，H-6′)，7.02 (1H，s，H-2″)，6.73 (1H，brs，H-6″)，6.48 (1H，brs，H-5′)，6.47 (1H，d，J=12.0 Hz，H-5″)，5.82 (1H，brs，H-6)，5.57 (1H，brs，H-8)，5.51 (1H，brs，H-a)，4.76 (1H，d，J=12.0 Hz，H-2)，4.19 (1H，d，J=12.0 Hz，H-3)，3.67 (1H，m，H-γ)，3.61 (3H，s，3″-OCH3)，3.52 (1H，brs，H-β)，3.29 (1H，brs，H-β)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 105.6 (C-1″)，79.5 (C-2)，72.4 (C-3)，200.3 (C-4)，153.9 (C-5)，94.2 (C-6)，146.9 (C-7)，95.1 (C-8)，156.4 (C-9)，99.8 (C-10)，122.6 (C-1′)，115.3 (C-2′)，140.2 (C-3′)，136.9 (C-4′)，111.8 (C-5′)，100.2 (C-6′)，143.1 (C-1″)，105.3 (C-2″)，150.2 (C-3″)，145.3 (C-4″)，113.5 (C-5″)，120.2 (C-6″)，80.2 (C-a)，49.5 (C-β)，58.7 (C-γ)，56.1 (3″-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為isosilychristin。

化合物13：白色粉末(丙酮)。ESI-MSm/z: 271.3[M + Na]+。1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ: 6.68 (1H，t，J=8.2 Hz，H-7)，6.31 (1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，5.73 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，4.08 (1H，s，H-1)，2.63 (3H，s，H-CH3)，2.32 (3H，s，H-CH3)；13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6)δ: 67.2 (C-1)，65.3 (C-2)，69.3 (C-3)，195.8 (C-4)，163.9 (C-5)，116.1 (C-6)，137.2 (C-7)，118.4 (C-8)，111.7 (C-9)，143.2 (C-10)，29.2 (2-CH3)，16.3 (5-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為3-acetyl-2-methyl-1，5-dihydroxy-2，3-epoxynaphth-oquinol。

4 抗炎活性篩選

采用Griess法[18]檢測化合物1～13對氯化鈷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中神經(jīng)遞質(zhì)(5-羥色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影響，以神經(jīng)節(jié)苷脂為陽性對照藥物。將PC12細(xì)胞稀釋成6×105/mL密度的單細(xì)胞懸液，每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以每孔100 μL置于96孔板中，在37 ℃、5% CO2填充的培養(yǎng)箱中孵化24 h，每孔分別加入10 μL MTT試劑染色，孵育6 h，離心，取上層細(xì)胞清液，加入DMSO 60 μL，輕輕搖動(dòng)均勻，用酶標(biāo)儀檢測520 nm波長下的吸光度，采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算 IC50值。結(jié)果表明，化合物1、7對5-羥色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸具有改善作用，2對5-羥色胺、氨基丁酸具有保護(hù)作用，11對氨基丁酸、甘氨酸具有保護(hù)作用，12對5-羥色胺具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，見表1。

表1 各化合物對神經(jīng)遞質(zhì)的 IC50值

5 討論

本研究從錫葉藤中分離鑒定出13個(gè)化合物，均為首次從錫葉藤中分離得到。再測定所得化合物對神經(jīng)遞質(zhì)(5-羥色胺、氨基丁酸、甘氨酸、谷氨酸)的影響，結(jié)果顯示化合物1～2、7、11～12具有不同程度的改善作用。本研究可豐富錫葉藤化學(xué)成分的資源庫，并為保護(hù)神經(jīng)藥物的研發(fā)提供參考。