陳 蓉， 徐 俊， 陳華林， 康晉梅， 敬 勇， 李 敏

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137)

俄色果來源于薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.) Hughes.或花葉海棠Malustransitoria(Batal.) Schneid.的干燥成熟果實，為甘孜藏族自治州民間的一味習(xí)用藥材，具有悠久藥用及食用歷史。俄色果在《如意寶樹》[1]《晶珠本草》[2]《藏藥晶鏡本草》[3-4]《新修晶珠本草》[5]和《中華藏本草》[6]中均有記載。俄色果味甘、酸，性平，具有清肺疾，排(化)痰、健胃、降血壓等作用。俄色果富含三萜類、有機酸、黃酮、多糖、維生素、氨基酸等成分，聶繼云等[7]研究發(fā)現(xiàn)變?nèi)~海棠果實含有多種二氫查耳酮、黃酮醇類以及花青苷類類黃酮成分。目前甘孜州爐霍雪域俄色有限責(zé)任公司制備俄色果酒[8]和果丹皮[9]，有將俄色果制成保健茶或預(yù)防高原反應(yīng)的膠囊劑[10-11]或應(yīng)用于保肝的藥物或保健食品中的報道[12-13]，俄色果在藥用和食用方面均具重要價值。俄色果的現(xiàn)代藥理研究較少，僅課題組前期對其降血脂、保肝以及抗氧化作用進行了初步研究。尚未見到對俄色果體外抑制α-淀粉酶活性的報道。

據(jù)報道，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生與機體的氧化應(yīng)激水平有關(guān)，其誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)是導(dǎo)致糖尿病和代謝綜合癥等多種慢性疾病的重要因素[14]。α-淀粉酶抑制劑主要通過抑制腸道內(nèi)唾液和胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分攝取，降低血糖和血脂水平。通過系統(tǒng)溶劑法梯度萃取俄色果水和95%乙醇提取的混合部位，得到5種俄色果不同極性部位，采用DPPH、ABTS自由基清除實驗對5種不同極性部位的抗氧化活性進行研究，選擇豬胰-α-淀粉酶為藥物靶點，以淀粉為底物，阿卡波糖為陽性對照藥，采取體外酶抑制活性檢測方法對5種極性部位的α-淀粉酶抑制活性進行篩選，確定α-淀粉酶抑制活性部位，以期為開發(fā)相關(guān)保健品和藥物提供參考。

1 材料

1.1 樣品 俄色果由四川省爐霍雪域俄色有限公司2019年10月下旬采摘提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)李敏教授鑒定為薔薇科植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.) Hughes.的干燥成熟果實。稱取100 g，粉碎，過24目篩，置于5 000 mL圓底燒瓶中，按1∶20的料液比加入2 000 mL 95%乙醇回流提取2次，每次2 h，趁熱過濾，殘渣再加10倍量水煎煮2次，每次2 h，趁熱過濾，合并2次醇提濾液，減壓回收乙醇至無醇味；合并2次水提濾液，與醇提液并濃縮得浸膏，將浸膏用水分散，使其充分混勻，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇萃取，每次300 mL，連續(xù)3 次，剩余部分為水部分，回收各部位萃取溶劑于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，真空干燥至干，最終得到水、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5個萃取部位樣品粉末[15-17]。

1.2 試劑 熊果酸(四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%，批號wkq18012906)；豬胰-α-淀粉酶(上海源葉生物科技有限公司,批號S08M10I87687)；二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH，上海源葉生物科技有限公司,批號S14O10M99952)；2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號M9403A)；2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪(TPTZ，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號A0301A)；阿卡波糖(上海源葉生物科技有限公司，批號S25M11X109783)；抗壞血酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號J1024A)；2，6-二叔丁基對甲酚(BHT，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號D1026A)。

1.3 儀器 SQP電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；A580紫外分光光度計[翱藝儀器(上海)有限公司]；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PHS-3E型雷磁PH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1 三萜類成分測定 用乙醇配制100 μg/mL熊果酸對照品溶液。精密稱取樣品約100 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入約8 mL乙醇，超聲45 min后取出，放冷至室溫，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。準確吸取對照品溶液0.125、0.25、0.5、0.75、1 mL和樣品溶液0.2 mL于5 mL比色管中，氮氣揮干溶劑后進行測定[18]。以熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)繪制熊果酸標準曲線，計算不同極性部位的三萜成分含量。

2.2 DPPH自由基清除試驗 準確稱取DPPH 0.04 g，用乙醇溶解，將溶解液轉(zhuǎn)移到1 000 mL量瓶中定容，搖勻待用。根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，將俄色果不同極性部位用0.1%DMSO溶液制備成一定濃度的樣品溶液，吸取100 μL樣品溶液加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液中，密塞，搖勻，避光37 ℃水浴30 min。在517 nm波長處以乙醇為參比試劑，測定樣品吸光度As；對照組以乙醇代替DPPH溶液和100 μL樣品溶液反應(yīng)，得樣品溶液本底吸光度A0；空白組以0.1%DMSO溶液代替樣品溶液和3.9 mL 0.1 mmol/LDPPH乙醇溶液反應(yīng)，得DPPH吸光度A1，以人工抗氧化劑BTH為陽性對照，實驗重復(fù)3次，計算各濃度樣品的DPPH自由基清除率，最后結(jié)果以SC50值表示，即DPPH自由基清除率為50%時反應(yīng)池中樣品的終濃度。清除率=[1-(As-A0)/A1]×100%，式中As為樣品測定管吸光度，A0為各樣品溶液本底吸光度，A1為空白組吸光度。

2.3 ABTS自由基清除試驗 將7 mmol/L ABTS和4.9 mmol/L過硫酸鉀等體積混合后，在黑暗室溫下放置16 h，用無水乙醇稀釋至吸光度0.70±0.05(734 nm波長)，作為ABTS自由基工作液。根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，將俄色果不同極性部位用0.1%DMSO溶液制成一定濃度的樣品溶液，將100 μL樣品溶液加到試管中，再分別加入3.9 mL ABTS自由基工作液，渦旋振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，于734 nm波長處以乙醇為參比試劑，測定樣品反應(yīng)后的吸光度AS；對照組以無水乙醇代替ABTS溶液反應(yīng)，得樣品溶液本底吸光度A0；空白組以0.1%DMSO溶液代替樣品溶液反應(yīng)，得ABTS吸光度A1，以人工抗氧化劑BTH為陽性對照，重復(fù)3次，計算ABTS自由基清除率，結(jié)果以SC50表示。清除率=[1-(As-A0)/A1]×100%，式中As為樣品測定管吸光度，A0為各樣品溶液本底吸光度，A1為空白組吸光度。

2.4 總抗氧化能力測定 精密移取0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液，與10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L的三氯化鐵溶液按照10∶1∶1比例混合，制得質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL的FRAP工作液。根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，將各部位均制成質(zhì)量濃度為0.17 mg/mL的溶液，取待測樣品溶液100 μL，加入3.9 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液，漩渦振蕩混勻后37 ℃水浴反應(yīng)10 min，于593 nm處讀取吸光度，每份樣品平行測定3次，計算FRAP值。以FeSO4為標準物質(zhì)，濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，所有實驗均重復(fù)3次，以超純水代替樣品作為本底吸光度。樣品的總抗氧化能力以FRAP值表示，以1.0 mmol/L的 FeSO4為標準，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度值為1個FRAP值(樣品總抗氧化能力以達到同樣吸光度所需FeSO4濃度來表示)。

2.5 俄色果不同極性部位對豬胰-α-淀粉酶抑制活性篩選 根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，將俄色果不同極性部位用0.1%DMSO溶液制備成一定濃度的樣品溶液，吸取250 μL，加入125 μL含α-淀粉酶液的PBS溶液，在37 ℃下保溫10 min后，添加250 μL 1%淀粉溶液，在37 ℃下反應(yīng)5 min。加入0.5 mL DNS溶液顏色劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min后立即取出，置冰水中迅速冷卻，加入5 mL去離子水進行稀釋，搖勻后在540 nm 波長處測定吸光度。以PBS作為空白對照，阿卡波糖作為陽性對照，設(shè)對照空白消除背景顏色，每個樣品重復(fù)3次，取平均值，計算α-淀粉酶抑制率，結(jié)果以IC50表示。抑制率={1-[(As-A0′)/(A1-A0)]}×100%，式中As為樣品測定管吸光度，A0′為以磷酸緩沖液代替酶溶液的樣品溶液本底吸光度，A1為以磷酸緩沖液代替樣品溶液作為空白組的吸光度，A0為以磷酸緩沖液代替樣品溶液,酶溶液作為空白組的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 三萜類成分含量測定 以熊果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，對應(yīng)吸光度為縱坐標(A)進行回歸，得方程A=0.045 1X-0.036(r=0.999 6)。其中，二氯甲烷部位的三萜類成分含量最高，為(4.068±0.668)%，其次為石油醚部位、水部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位，見表1。

表1 俄色果不同極性部位的三萜類成分含量測定結(jié)果

3.2 對DPPH自由基的清除作用 由圖1可知，各極性部位對DPPH自由基均具清除作用，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表2顯示，各極性部位對DPPH自由基清除作用的SC50值從小到大依次為二氯甲烷部位、石油醚部位、水部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，可以看出俄色果清除DPPH自由基的主要活性成分集中在二氯甲烷和石油醚部位；BHT的SC50值低于俄色果各部位的SC50值(P<0.05)，表明俄色果清除DPPH自由基的能力低于BHT；俄色果各部位清除DPPH自由基的SC50值與三萜類成分具有顯著相關(guān)性(r=-0.848)，因此，各部位DPPH自由基清除能力可能與后者有關(guān)。

圖1 俄色果不同極性部位對DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of different extract parts of Ese fruit on DPPH

3.3 對ABTS自由基的清除作用 由圖2可知，各極性部位對ABTS自由基均具清除作用，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表3顯示，各極性部位對ABTS自由基的清除作用的SC50值從小到大依次為石油醚部位、乙酸乙酯部位、二氯甲烷部位、正丁醇部位、水部位，可以看出俄色果清除ABTS自由基的主要活性成分集中在石油醚部位；BHT的SC50值與俄色果石油醚部位的SC50值無統(tǒng)計學(xué)差異(P≥0.05)，表明兩者清除ABTS自由基的能力相當；俄色果各部位清除ABTS自由基的SC50值與三萜類成分相關(guān)度較低(r=-0.505)，推斷其他成分在起作用，或三萜與其他成分共同作用。

表2 俄色果各極性部位對DPPH自由基清除的SC50值

圖2 俄色果不同極性部位對ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of different extract parts of Ese fruit on ABTS

3.4 總抗氧化能力 按“2.4”項下方法測得FeSO4標準物質(zhì)方程為Y=0.461 5X+0.006 3(r=

表3 俄色果各極性部位對ABTS自由基清除的SC50值

0.999 3)，線性關(guān)系較好。由圖3可知，同濃度各極性部位的FeSO4當量從大到小依次為石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位，可以看出俄色果的石油醚和二氯甲烷部位的抗氧化能力最強，活性成分集中在這2個部位；同濃度BHT的FeSO4當量大于俄色果各部位的(P<0.05)，表明俄色果抗氧化能力低于BHT；俄色果各部位的FRAP值與三萜類成分具有很大的相關(guān)性(r=0.864)，推測各部位的總抗氧化能力可能與后者有關(guān)。

注：不同小寫字母表示數(shù)據(jù)之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖3 俄色果不同極性部位總抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity of different extract partsof Ese fruit

3.5 俄色果不同極性部位對豬胰-α-淀粉酶抑制活性 由圖4可知，各部位均表現(xiàn)出豬胰-α-淀粉酶抑制作用，并呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。表4顯示，各部位抑制豬胰-α-淀粉酶的IC50值從小到大依次為二氯甲烷部位、石油醚部位、正丁醇、水部位、乙酸乙酯部位，可以看出俄色果抑制豬胰-α-淀粉酶的主要活性成分主要集中在二氯甲烷部位，石油醚部位次之；阿卡波糖對豬胰-α-淀粉酶抑制的IC50值顯著小于二氯甲烷部位的IC50值(P<0.05)，表明俄色果抑制作用小于阿卡波糖；俄色果各部位抑制α-淀粉酶的IC50值與三萜類成分相關(guān)性不大(r=-0.538)，但如果除去水部位，其他部位的IC50值與三萜類成分呈顯著相關(guān)(r=-0.636)，說明后者多種活性成分共同作用。

圖4 俄色果不同極性部位對豬胰-α-淀粉酶的抑制活性Fig.4 Inhibitory effects of different extract parts of Ese fruit on porcine pancreatic α-amylase

表4 俄色果不同極性部位對豬胰-α-淀粉酶抑制的IC50值

4 討論

實驗結(jié)果表明，俄色果各提取部位中，二氯甲烷和石油醚部位的三萜類成分含量明顯高于其他部位。各部位均具有抗氧化和α-淀粉酶抑制作用。其中，二氯甲烷和石油醚部位的DPPH自由基清除作用、總抗氧化能力以及α-淀粉酶抑制作用較其他部位強，石油醚部位的ABTS自由基清除作用較其他部位強，可見俄色果抗氧化和降血糖的主要活性成分集中在二氯甲烷和石油醚部位。通過三萜類成分含量與抗氧化和α-淀粉酶抑制作用的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，三萜類成分與DPPH自由基清除作用、總抗氧化能力呈顯著相關(guān)，與ABTS自由基清除作用和α-淀粉酶抑制作用有一定的相關(guān)性，但相關(guān)度較低，這意味著可能存在其他成分在起作用或三萜類與其他成分共同作用，除去俄色果水部位后進行分析，發(fā)現(xiàn)各部位的三萜類成分與α-淀粉酶抑制作用呈顯著相關(guān)性，表明其他α-淀粉酶抑制成分主要分布在俄色果水部位。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，相比化學(xué)藥物，天然植物有效成分具有良好的藥理活性和很小的不良反應(yīng)，且多種活性成分均具有降血糖作用。研究表明三萜類成分、有機酸、黃酮、多酚、多糖、多肽、皂苷、酵素等均具有α-淀粉酶抑制作用[19-20]，三萜類成分是具有神經(jīng)保護潛能的α-淀粉酶抑制劑[20]，具有開發(fā)為防治糖尿病保健品和藥物的前景。阿卡波糖對α-淀粉酶具有強抑制作用，導(dǎo)致未消化的多糖在腸道內(nèi)聚集，在腸道菌群的作用下放出氣體和其他低分子物質(zhì)，因此服用阿卡波糖常常伴有胃腸脹氣和腸鳴音、腹痛、腹脹、腹瀉等不良反應(yīng)[21]。α-淀粉酶抑制劑是有效的降血糖手段，俄色果提取物對α-淀粉酶有明顯的抑制作用，但效果不如阿卡波糖，表明俄色果可能在發(fā)揮作用的同時也會減少腸道方面的不良反應(yīng)。汪冬善[22]在對同屬植物紅玉海棠和湖北海棠的果實降膽固醇作用有效部位篩選時發(fā)現(xiàn)氯仿部位明顯降低高脂小鼠的空腹血糖，這對俄色果降血糖作用的研究具有一定指導(dǎo)作用。通過測定俄色果各部位三萜類成分和篩選抗氧化和對豬胰-α-淀粉酶活性部位，以期為深入研究俄色果活性化合物，篩選抗氧化和降血糖活性成分奠定基礎(chǔ)，今后還需結(jié)合動物體內(nèi)試驗研究降血糖效果，以及現(xiàn)代化學(xué)和藥理知識進一步篩選出明確的活性成分和降血糖作用及其機制。