郭鵬波，章波，王彥紅，高利飛

（1.鄭州兒童醫(yī)院 兒科醫(yī)學(xué)研究所，河南 鄭州 450000；2.安圖生物，河南 鄭州 450000）

百日咳是由百日咳鮑特菌(Bordetella pertussis)侵入人體呼吸道而引起的急性呼吸道傳染病[1]。主要特征是陣發(fā)性痙攣性咳嗽，且咳嗽時(shí)間為2～3個(gè)月，故名"百日咳"[2]。百日咳是由革蘭陰性桿菌引起的高度傳染性呼吸道疾病[3]。盡管疫苗覆蓋率很高，但近日百咳仍在復(fù)蘇[4]，且對人類健康產(chǎn)生巨大威脅[5]。由于百日咳鮑特菌毒性區(qū)和致病因子比較復(fù)雜，在最近的10～20年內(nèi)，全球百日咳患病人數(shù)有明顯的上升趨勢[6]，且在我國陜西、天津和新疆等地百日咳患者也有增加的趨勢[7-9]。由于中國的百日咳發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，如何在發(fā)病早期快速診斷和檢驗(yàn)出百日咳鮑特菌，已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道的有細(xì)菌培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫檢測法、核酸檢測法等多種方法，核酸檢測法雖然敏感度最高[10]，但操作技術(shù)要求高，限制了本方法的臨床應(yīng)用。本文對百日咳的熒光定量實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，建立了快速的便攜式百日咳鮑特菌核酸檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 臨床樣本來自鄭州兒童醫(yī)院，百日咳鮑特菌DNA 來源于河南CDC，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于凱杰生物公司，PCR 產(chǎn)物純化及質(zhì)粒DNA 抽提試劑盒購自TaKaRa 公司，2×Taq PCR MasterMix(KT201)購自北京天根生化技術(shù)有限公司,引物合成和測序由上海生工生物有限公司、抗干擾Taq 酶購自百奧萊博。主要儀器有Thermo Nano-Drop 2000c 超微量紫外分光光度計(jì)、Biometra TT100PCR 儀、博醫(yī)康Pilot5-8S 冷凍干燥機(jī)及安捷倫熒光定量PCR 儀。

1.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以百日咳鮑特菌DNA 為模板，以IS481 上下游為引物(IS481F1:5'-CTAGGTGTGAAGATTCAATAG-3'；IS481R1:5'-TAGCTGTGAAGATTCAA-3') 進(jìn)行PCR 反應(yīng)。應(yīng)總體系20μl,含1μl 提取產(chǎn) 物、上下游 引物各0.5μl(10mM)、10μl 2×Taq PCR MasterMix和ddH2O(補(bǔ)足到20μl)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃5min，變性94℃30sec、退火55℃30sec、延伸72℃1min，30個(gè)循環(huán)，之后延伸72℃l0min。用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析片段。將PCR 產(chǎn)物用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 4.0 進(jìn)行切膠回收純化后，連接到PUC57 載體上，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，進(jìn)行氨芐(Ampicillin) 抗性篩選。選取含陽性質(zhì)粒的菌液送擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行比對，結(jié)果顯示序列一致。抽提質(zhì)粒，經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)準(zhǔn)確定量后計(jì)算拷貝數(shù)，梯度稀釋之后可以作為QPCR的定量模板標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì) 參考GenBank 中百日咳鮑特菌IS481基因序列(登錄號BX470248)，采用Primer 5.0 軟件，設(shè)計(jì)出了一組引物探針用檢測百日咳鮑特菌，擴(kuò)增長度為156bp（IS481F:5'-ACCGCTTTACCCGACCTTACCG -3';IS481R:5' -GATGCCAGTTGTAGTGGTGTAGCC-3';P:5'-CATCCA GTCGGCCTTGCGTGAGTGG-3'），探針5’端FAM報(bào)告基因，3’端標(biāo)記BHQ1 淬滅集團(tuán)。引物探針特異在NCBI 上進(jìn)行BLAST 驗(yàn)證，均由上海生工生物公司合成并純化。

1.4 檢測體系的建立及凍干處理 拭子樣本的洗脫，采用病毒采樣液洗脫拭子樣本。洗脫液充當(dāng)了后續(xù)凍干體系的復(fù)溶液。

本檢測體系采用抗干擾Taq 酶和抗干擾PCR反應(yīng)緩沖體系，實(shí)現(xiàn)咽拭子洗脫物直接擴(kuò)增檢測。同時(shí)采用凍干式PCR 試劑，即添加凍干保護(hù)劑，將PCR 體系凍干，實(shí)現(xiàn)PCR 試劑體系的一管式常溫穩(wěn)定存儲(chǔ)，只需添加樣本即可直接在Q-PCR 儀器上反應(yīng)檢測，降低操作復(fù)雜度，實(shí)現(xiàn)核酸檢測的便捷化操作。

凍干用Q-PCR 液體試劑的配制（PCR 反應(yīng)總體系20μl）：上下游引物各1.2μl(10mM)、0.6μl的TaqMan Probe (10mM)、2μl 抗干擾Taq 酶（5U/μl）、10μl 2×抗干擾qPCR buffer、5ul 4×凍干保護(hù)劑。

Q-PCR 試劑凍干：Q-PCR 試劑在超低溫冰箱冷凍Q-PCR 液體試劑12h,將凍干機(jī)預(yù)凍2h、再將預(yù)凍好的試劑放入凍干機(jī),在凍干機(jī)內(nèi)一次升華干燥-30 攝氏度10h、二次升華干燥45℃5h、三次升華干燥40℃8h。用鋁塑膜將凍干好的試劑真空塑封，常溫儲(chǔ)存。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min 后，95℃變性10sec、60℃延伸30sec（采集熒光），40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值。

1.5 檢測體系靈敏度評價(jià) 利用所建立的Q-PCR反應(yīng)體系，以滅菌雙蒸水為陰性質(zhì)控品，以百日咳鮑特菌NCTC58209 標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA 樣品做為陽性質(zhì)控品。檢測用TE 連續(xù)10 倍稀釋至濃度在1.0×101～1.0×107copies/mL 間的質(zhì)粒DNA 樣品，來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的靈敏度，Q-PCR 擴(kuò)增檢測，以Ct 值為縱坐標(biāo)，濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，確定檢測靈敏度。

1.6 檢測體系特異性評價(jià) 采用陰性標(biāo)本、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌檢測，評價(jià)檢測體系特異性。

1.7 檢測體系重復(fù)性評價(jià) 選擇不同稀釋度的3個(gè)標(biāo)本進(jìn)行定量PCR 檢測,每個(gè)樣本重復(fù)10 次,通過計(jì)算同一樣本Ct 值的差異來驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

1.8 臨床樣本應(yīng)用評價(jià) 收集2018年6 月-2019年2 月鄭州兒童醫(yī)院收治的上呼吸道感染患者，咽拭子樣本227例，采用建立的Q-PCR 體系對所收集的上呼吸道感染者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢側(cè)。檢測陽性樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物，用基因測序進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度 評價(jià)結(jié)果我們對1.0×107～1.0×101copies/ml的IS481 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Q-PCR 檢測分析,結(jié)果10copies/ml 樣品未檢出，1.0×107copies/ml～1.0×102copies/ml 樣品檢出；選擇有陽性檢出的1.0×107copies/mL～1.0×102copies/ml 反應(yīng)點(diǎn)，以質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)為X 軸，以檢測Ct 值為Y 軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,我們獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=-3.4857X+39.2，即斜率為-3.4857，相關(guān)系數(shù)為0.9936（圖1），相關(guān)系數(shù)符合要求，我們確定本檢測體系檢出限約為100copies/ml。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 特異性評價(jià)結(jié)果 陰性標(biāo)本、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌檢測無特異性擴(kuò)增曲線，結(jié)果均呈陰性。

圖2 熒光定量PCR 靈敏度試驗(yàn)(A～G1.0×107～1.0×101copies/ml)

2.3 重復(fù)性評價(jià)結(jié)果 3 個(gè)標(biāo)本重復(fù)性檢測結(jié)果見表1 。CV在合理范圍內(nèi)（＜2%），說明構(gòu)建的檢測體系具有良好的可重復(fù)性。

表1 熒光定量PCR 方法檢測百日咳的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 臨床樣本檢測通過所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，對所收集得到的227例急性上呼吸道感染者的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR 檢測出9 份陽性，其陽性率為3.96%。檢測結(jié)果見表2。9例陽性樣本的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)基因測序鑒定為百日咳基因序列，說明反應(yīng)體系檢測準(zhǔn)確。

表2 9 份陽性樣本檢測Ct 值

3 討論

最近幾年，百日咳感染和傳播患者的發(fā)病率出現(xiàn)升高的情況，且在接種疫苗的區(qū)域患者人數(shù)也呈現(xiàn)逐年增加的趨勢。張德著等[11]對貴州省百日咳頻發(fā)地區(qū)的605 份健康人血清抗體水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)健康人群血清中百日咳鮑特菌總IgG水平較低。因此，盡管存在接受疫苗免疫的人群，但仍然可能有感染百日咳的風(fēng)險(xiǎn)。由于患病風(fēng)險(xiǎn)的增加，且百日咳的診斷標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，實(shí)驗(yàn)室還未有完整的百日咳相關(guān)早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)上述原因和影響可能會(huì)導(dǎo)致百日咳早期患者診斷受到延誤，增大了患者的病痛和傳染源風(fēng)險(xiǎn)[12,13]。

百日咳菌的樣本采集按照美國疾病預(yù)防與控制中心(CDC)推薦的鼻咽拭子標(biāo)本方法[14]。采用培養(yǎng)鑒別的方法因?yàn)闀r(shí)間周期比較長對臨床早期診斷價(jià)值不大。通過酶聯(lián)反應(yīng)來檢測相應(yīng)的抗體存在，可以用來檢驗(yàn)百日咳，但檢測樣本需要比較急性期和恢復(fù)期成對的血清標(biāo)本,不利于早期診斷[15]。Q-PCR 熒光探針檢測方法具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)[16],但操作要求高,需要在專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)室檢測，檢測流程涉及核酸提取，PCR 體系構(gòu)建，PCR 擴(kuò)增檢測等系列專業(yè)技術(shù)環(huán)節(jié)，不便于臨床廣泛推廣應(yīng)用。本研究建立了一種簡便式百日咳核酸檢測方法，不需要核酸提取，不需要PCR 體系構(gòu)建，采用樣本直接擴(kuò)增，凍干式全組分PCR 體系，實(shí)現(xiàn)了拭子洗脫物直接加樣PCR 檢測，極大簡化了操作步驟，降低了操作技術(shù)要求，本技術(shù)具有POCT 核酸檢測的可能性，為百日咳鮑特菌的分子診斷新途徑奠定基礎(chǔ)。

通過采用本研究建立的百日咳檢測體系對鄭州地區(qū)的百日咳樣本進(jìn)行篩查，結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)鄭州地區(qū)呼吸道感染住院兒童百日咳陽性率為3.96%左右，百日咳病情有增加 的趨勢。提示應(yīng)盡快開發(fā)并完善百日咳檢測方法，使百日咳患者能夠盡快確診，以便協(xié)助臨床醫(yī)生診治百日咳。