王照華，楊 越，徐景超，張雁儒

（河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院1，骨科研究所2，河南 焦作 454000）

鎂合金是因骨折而進(jìn)行的骨修復(fù)中常見的骨支架材料。骨支架對骨折的康復(fù)發(fā)揮協(xié)同作用，而最理想的支架材料應(yīng)能在術(shù)后初期發(fā)揮其機(jī)械特性，起到固定支撐骨組織的作用，待骨組織愈合后可逐漸自行降解和消失[1]。骨支架材料一般分為生物降解型和非生物降解型，傳統(tǒng)的非生物降解型的骨支架僅能支持骨組織，維持其形態(tài)。其優(yōu)點(diǎn)在于耐磨損、韌性高、穩(wěn)定性強(qiáng)。但存在需要二次手術(shù)取出的情況，增加了患者痛苦與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，降解型材料是主要的生物材料發(fā)展方向，鎂合金作為一種新型生物植入材料，與人體有較高的生物相容性，且容易降解[2]。鎂離子是人體必需的常量元素[3]，但其也有韌性較差、降解過快等風(fēng)險(xiǎn)性。目前對鎂合金生物材料的研究大多傾向于降解過程、生物安全性、生物力學(xué)等方向，而對其于骨生長的影響與抗菌性能研究較少[4]?？晌招枣V合金植入物在生物體內(nèi)的應(yīng)用效果與抗菌性能仍需探究。故本研究以家兔為研究對象設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，植入新型可降解鎂合金螺釘，觀察其降解效果與抗菌性能，探究其生物安全性以及對骨生長的影響，旨在為新型可降解鎂合金植入物在臨床方面的選擇與應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料 健康白色成年新西蘭家兔20只，雌雄不拘，體質(zhì)量4.1～4.8 kg，體溫38.5 ℃～39.5 ℃，由河南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房提供。飼育室室溫（20±3）℃，相對濕度50%～60%，晝夜光照節(jié)律12 h∶12 h，兔糧食用量為400～500 g/d，自由飲食水。對實(shí)驗(yàn)動物的處理與實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆先祟惖牡赖聜惱順?biāo)準(zhǔn)和國際慣例，符合3R 規(guī)則。細(xì)菌菌株：感染動物所用細(xì)菌由河南理工大學(xué)病原生物實(shí)驗(yàn)室提供的金黃色葡萄球菌菌液（S.aureus）（1×1011/L）。新型可降解鎂合金螺釘：植入體內(nèi)的兔用新型可降解鎂合金螺釘由焦作市新港醫(yī)療設(shè)備有限公司提供，主要材料：Mg3Zn1Ag。病理切片相關(guān)儀器與試劑：BQ-318D 石蠟切片機(jī)（湖北伯納醫(yī)療科技有限公司）、HS-1145病理組織漂烘儀（金華市華速科技有限公司）、Bx53熒光倒置顯微鏡[奧林巴斯（深圳）工業(yè)有限公司]、組織包埋盒、冰醋酸、甲醛、二甲苯、石蠟、乙醇（50%、75%、95%、無水乙醇）、水楊酸脫鈣液（鹽酸8 ml，醋酸5 ml 和水楊酸10 g）。手術(shù)器械及藥品：兔盒、兔用解剖臺、常用手術(shù)器械、克氏針、骨鉆、生理鹽水、10%水合氯醛、碘伏。金黃色葡萄球菌檢測：常用菌種接種器械、梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鎂合金加壓螺釘?shù)闹踩?將健康成年家兔隨機(jī)分為對照組與實(shí)驗(yàn)組，各10 只。于術(shù)前禁食3 d，捉拿稱重后經(jīng)兔盒固定后用10%水合氯醛溶液以2 ml/kg 的劑量，經(jīng)耳緣靜脈處注射進(jìn)行麻醉處理。待其角膜反射與疼痛反射消失后對手術(shù)部位進(jìn)行脫毛處理，俯臥位固定于消毒后的兔用解剖臺。術(shù)者洗手穿戴手術(shù)服，對手術(shù)部位及周圍用碘伏擦拭消毒，加蓋手術(shù)鋪巾并用布巾鉗固定。在體表可捫及大轉(zhuǎn)子處沿股骨向下方處做一長約2 cm 切口。用手術(shù)刀切開皮層與肌肉層直至股骨，組織鉗固定皮層并擴(kuò)開創(chuàng)口后，用止血鉗游離周圍肌肉。完全暴露出骨干，經(jīng)生理鹽水沖洗后用克氏針選擇骨干粗壯處鉆孔定位，再經(jīng)骨鉆擴(kuò)孔后向骨髓腔內(nèi)注射金黃色葡萄球菌液0.5 ml（1×1011/L）并加壓擰入鎂合金螺釘。沖洗并縫合創(chuàng)口。待清醒后術(shù)側(cè)活動無障礙、精神狀態(tài)良好、進(jìn)食正常即為手術(shù)成功，見圖1。對照組實(shí)驗(yàn)家兔行相同手術(shù)處理，不植入加壓螺釘。術(shù)后家兔實(shí)施單籠飼養(yǎng)，正常術(shù)后護(hù)理[5]。

圖1 鎂合金加壓螺釘?shù)闹踩胧中g(shù)

1.2.2 鎂合金螺釘?shù)挠跋駥W(xué)檢測 分別于術(shù)后30、60 d 對術(shù)側(cè)進(jìn)行X 射線影像學(xué)觀察。

1.2.3 骨組織切片觀察 術(shù)后60 d，實(shí)驗(yàn)家兔空氣栓塞法處死。解剖取其完整股骨，剔除肌肉組織觀察。之后用咬骨鉗截取需要部位。放入固定液中固定后再經(jīng)水楊酸脫鈣液脫鈣處理-除酸-梯度乙醇脫水-二甲苯透明-石蠟—二甲苯混合液浸透-液態(tài)石蠟浸透的步驟，即可進(jìn)行包埋切片[6]。選取完整的切片進(jìn)行漂片與攤片，將玻片烘片處理后經(jīng)逆梯度乙醇置水，再經(jīng)蒸餾水沖洗后以此進(jìn)行蘇木素染色-沖洗-伊紅染色-沖洗-梯度酒精脫水-二甲苯透明的步驟，最后滴加中性樹脂封片，制作成功后后使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察[7]。

1.2.4 金黃色葡萄球菌檢測 處死后于無菌環(huán)境下取手術(shù)部位周圍分泌物及部分組織，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，經(jīng)藥敏分析系統(tǒng)鑒定金黃色葡萄球菌是否存在。

1.3 觀察指標(biāo) ①影像學(xué)：觀察螺釘是否固定良好，周圍有無骨壞死，螺釘在植入期間有無緩慢降解；②股骨大體解剖觀察：周圍肌肉組織與骨髓腔是否出現(xiàn)炎癥，螺釘是否降解完全，有無膨大骨痂；③組織切片觀察：有無成骨細(xì)胞、壞死骨細(xì)胞，骨細(xì)胞排列形態(tài)，骨小梁形態(tài)；④金黃色葡萄球菌檢測：兩組分別取手術(shù)部位分泌物及組織培養(yǎng)后進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測，比較兩組陰性率。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢測結(jié)果 術(shù)后30、60 d 的影像學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 d 時(shí)可見螺釘已出現(xiàn)腐蝕，X 光片可見其螺紋模糊、螺釘直徑變小，但固定良好。且周圍骨組織無病變、壞死、塌陷等不良反應(yīng)。60 d 時(shí)已不可見螺釘，但可觀察到創(chuàng)口愈合后的骨痂。且周圍骨組織無病變無壞死，未有骨質(zhì)疏松樣癥狀，見圖2。

圖2 術(shù)后X 光攝像

2.2 股骨形態(tài)、HE 切片結(jié)果 實(shí)驗(yàn)家兔活動正常，未見術(shù)側(cè)異常、萎縮等癥狀。離體股骨經(jīng)肉眼觀察可見原植入螺釘處螺釘已完全降解。原螺釘植入處的骨組織增生，傷口愈合并形成膨大的骨痂，周圍肌肉組織無炎癥反應(yīng)見圖3；組織切片觀察：對膨大的骨痂部位包埋切片后行HE 染色處理，于顯微鏡下放大40 倍可見骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞迅速增長，細(xì)胞至無序排列，見圖4。與對照組相比，成骨細(xì)胞較多，且細(xì)胞排列更具有無序性，缺少細(xì)胞的有序性與致密性，植入物被成骨細(xì)胞填充，無壞死骨細(xì)胞，見圖5。

圖3 術(shù)后股骨形態(tài)

圖4 植入螺釘處經(jīng)HE 染色骨切片顯微觀察

圖5 對照組骨切片經(jīng)HE 染色

2.3 細(xì)菌種類鑒定 實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌陰性率為90.00%。對照組金黃色葡萄球菌陰性率為20.00%，證明鎂合金螺釘具有一定的抗菌效應(yīng)。

表1 金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果

3 討論

目前大量的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證明鎂合金植入物生物兼容性強(qiáng)、降解完全，是較為安全的生物材料[8]，而在目前的骨科植入物的研究中，醫(yī)用金屬材料仍被廣泛用于骨折固定。研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)金屬材料存在不銹鋼中的鎳離子可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)過敏性皮炎等癥狀的不足，鈷合金中的鈷鎳元素具有致敏性，鈦合金中的釩攝入體內(nèi)會導(dǎo)致機(jī)體血壓的變化等[9]。一些固定材料需二次手術(shù)取出，增加患者痛苦。故鎂合金作為生物材料受到廣大研究人員的關(guān)注。但鎂合金材料公認(rèn)的缺點(diǎn)在于韌性較差，降解速度過快，降解不完全[10]。本實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行的日常活動中未出現(xiàn)術(shù)側(cè)異常、萎縮等不良反應(yīng)。影像學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，螺釘逐漸降解，周圍骨組織未有骨質(zhì)疏松樣癥狀。證明新型可降解鎂合螺釘降解速度合理，降解完全。表明其相較于傳統(tǒng)加有抗菌涂層的鈦合金植入物相比，具有更加優(yōu)良的生物安全性，且避免二次手術(shù)[11]。

本次實(shí)驗(yàn)觀察實(shí)驗(yàn)組家兔股骨組織切片發(fā)現(xiàn)：植入鎂合金螺釘?shù)牟课怀晒羌?xì)胞增加，骨組織排列無序，相對于對照組骨細(xì)胞生長速度較快，證明其對骨生長與骨愈合具有一定的促進(jìn)作用。有學(xué)者表明其原因在于鎂離子是人體含量第2 位的陽離子，且半數(shù)以上的陽離子存在于骨組織中，其缺失可導(dǎo)致血鈣降低，易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，鎂離子對于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持也起到重要作用[12]。既往研究顯示，骨組織中富鎂環(huán)境下可刺激骨生成、提高細(xì)胞黏附率、抑制破骨細(xì)胞等作用。鎂離子能夠通過多個(gè)信號通路影響骨代謝，促進(jìn)新骨的形成從而刺激骨折愈合。鎂離子促骨生長機(jī)制與抗菌機(jī)制相協(xié)同，促進(jìn)手術(shù)部位骨組織的愈合且有效降低了術(shù)后骨髓炎等潛在風(fēng)險(xiǎn)，表明其更適宜作為髓內(nèi)植入物所使用。

王湛等[13]經(jīng)體內(nèi)植入鎂合金材料實(shí)驗(yàn)探究發(fā)現(xiàn)，對于新型鎂合金材料植入物在植入體內(nèi)對于革蘭陰性菌——大腸桿菌、革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌作用。而在體外實(shí)驗(yàn)中也具有較好的抗菌性能。本實(shí)驗(yàn)中金黃色葡萄球菌菌種檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組金黃色葡萄球菌陰性率為90.00%，且髓腔內(nèi)無骨髓炎并發(fā)，而對照組金黃色葡萄球菌陰性率為20.00%，表明新型可降解型鎂合金材料具有一定的抗菌性。其機(jī)制可能在于鎂降解產(chǎn)生的OH-表現(xiàn)為堿性，導(dǎo)致局部pH 的增高，而細(xì)菌的最佳生長pH 為7.4～7.6[14]。從pH 的方向抑制了細(xì)菌的生長，達(dá)到了抗菌的作用有關(guān)。另有學(xué)者認(rèn)為鎂離子的抑菌性能在于細(xì)菌胞膜外高濃度的金屬陽離子破壞了原內(nèi)外離子濃度差，形成新的內(nèi)外濃度差，從而阻礙一些細(xì)胞生長物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。并且金屬離子可能存在有使細(xì)胞內(nèi)酶失活的作用，從而影響細(xì)胞的正常生化反應(yīng)[15]，但具體原因尚不明確。

綜上所述，新型可降解型鎂合金材料在家兔體內(nèi)具有較高的生物安全性，排異反應(yīng)小的同時(shí)又具備了優(yōu)良的抗菌性能，有效抑制金黃色葡萄球菌，減少了骨髓炎、術(shù)后感染等潛在風(fēng)險(xiǎn)。但目前對于鎂合金材料抗菌性能的臨床研究仍較少，仍有待于對鎂合金植入物的非細(xì)胞毒性與鎂離子的具體生化反應(yīng)進(jìn)行研究，并評估其臨床上的生物效應(yīng)。