梁文菲，張熙，彭阿建，歐陽范馨，朱晨鴻，譚梅鑫，蘭宏偉，熊武

1湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，長沙410208；2湖南省腦科醫(yī)院湖南中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院；3湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形外科

間充質(zhì)干細胞（MSCs）是一類具有多向分化潛能和自我更新能力干細胞，具有來源廣泛、便于取材、免疫原性低等優(yōu)點。近年來，MSCs因其具有調(diào)節(jié)免疫［1］、抑制炎癥反應［2］等功能受到廣泛關(guān)注。然而當MSCs所處內(nèi)環(huán)境不同或機體功能發(fā)生變化時，其分泌功能將發(fā)生相應改變。而高糖環(huán)境可致MSCs數(shù)量、功能活性下降，增殖分化能力受損，并改變其分泌炎癥因子的能力［3］。研究顯示，某些中藥或中藥單體對MSCs增殖、凋亡、分泌炎癥相關(guān)因子等功能可產(chǎn)生顯著影響。人參皂苷Rg1是人參的主要有效成分之一，研究顯示其能夠促進人MSCs增殖，并具有抑制炎癥反應的作用［4-5］。動物實驗證實，人參皂苷干預骨髓間充質(zhì)干細胞可顯著降低糖尿病皮膚潰瘍大鼠血清炎癥因子水平［6］。關(guān)于人參皂苷Rg1能否通過調(diào)控高糖受損MSCs分泌炎癥因子從而發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應功能的機制尚未有相關(guān)研究。2020年4月—7月，我們觀察了在高糖環(huán)境下人參皂苷Rg1對人臍帶血間充質(zhì)干細胞（hUCBMSCs）分泌炎癥因子的影響，旨在進一步探討人參皂苷Rg1調(diào)控炎癥反應的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人臍帶血來源無菌條件下取健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)胎盤中的臍帶血10 mL。本研究獲得我院倫理委員會批準，產(chǎn)婦及家屬均同意且簽署知情同意書。

1.1.2 主要藥品與試劑人參皂苷Rg1（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；青霉素—鏈霉素雙抗溶液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清、胰酶（美國GIBCO公司）；成骨誘導分化培養(yǎng)基、成脂誘導分化培養(yǎng)基、成軟骨誘導分化培養(yǎng)基（美國Cyagen公司）；茜素紅染液、油紅O溶液（美國Sigma公司）；阿利新藍染液（中國MesGen公司）；白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素10（IL-10）、巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）ELISA試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.1.3 主要儀器CO2細胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；熒光顯微鏡（北京同舟同德公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Thermo Fisher公司）；生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.2 hUCBMSCs的分離與培養(yǎng)將臍帶血加入肝素抗凝，室溫靜置30～60 min。取1.077 g/mL淋巴細胞分離液5 mL加入15 mL離心管中，緩慢將10 mL臍帶血與PBS液1∶1混合稀釋的細胞懸液加入淋巴細胞分離液中。經(jīng)密度梯度離心后，取單個核細胞移入含有5%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素雙抗溶液的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)7 d后將傳代到第3代的細胞凍存。將凍存的第3代hUCBMSCs進行細胞復蘇后，移入培養(yǎng)皿中，標志為第4代，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 hUCBMSCs的鑒定當?shù)?代hUCBMSCs細胞融合到80%～90%時，加入胰酶消化，將細胞懸液接種到明膠包被的24孔板，每組設4個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合到60%～70%時，分別按照成骨誘導分化培養(yǎng)基、成軟骨誘導分化培養(yǎng)基、成脂肪誘導分化培養(yǎng)基說明書要求，將細胞移入相應培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)基，觀察細胞形態(tài)變化及生長情況，分別用茜素紅、阿爾新藍及油紅O染液進行染色以確定細胞成骨、成軟骨、成脂肪誘導分化效果，并將培養(yǎng)基置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。細胞成骨誘導分化后經(jīng)茜素紅染液染色細胞內(nèi)可見紅色結(jié)節(jié)沉積，成軟骨誘導分化后經(jīng)阿利新藍染液染色可見細胞呈藍色樣改變，成脂誘導分化后經(jīng)油紅O染液染色可見細胞呈紅色樣改變，鑒定細胞為正常MSCs。

1.4 細胞分組與處理將鑒定成功的hUCBMSCs隨機分為正常組、模型組、干預組。正常組加入DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，模型組和干預組加入含30 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，建立高糖受損細胞模型。5 d后正常組和模型組再加入PBS培養(yǎng)48 h，干預組加入等體積質(zhì)量濃度為40 mg/L的人參皂苷Rg1培養(yǎng)48 h。

1.5 細胞上清液中炎癥因子水平檢測收集三組細胞上清液，分別加入標準品稀釋液、緩沖液、檢測抗體稀釋液，振蕩，室溫孵育后洗板，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，振蕩，室溫孵育后洗板，最后加入顯色底物TMB和終止液，使用酶標儀測定上清液中IL-1、IL-6、IL-10、M-CSF、MCP-1在450 nm的OD值。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間均值比較采用ANOVA法，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與正常組相比，模型組細胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1水平升高（P均<0.05）；與模型組相比，干預組細胞上清液中IL-1、IL-6水平降低，IL-10、MCSF水平升高（P均<0.05）。見表1。

表1 三組細胞上清液中炎癥因子水平比較（±s）

表1 三組細胞上清液中炎癥因子水平比較（±s）

注：與正常組相比，*P<0.05；與干預組相比，△P<0.05。

組別模型組干預組正常組IL-1 41.63±5.54*32.94±3.87△22.90±1.23 IL-6 113.29±6.91*45.43±5.41△28.12±6.79 IL-10 1.94±0.84 5.37±1.47△2.97±0.39 M-CSF 4.30±0.30 8.25±0.98△4.88±0.29 MCP-1 3 516.91±149.40*3 118.97±226.74 1 315.21±298.75

3 討論

糖尿病是以長期慢性高血糖為特征的代謝障礙性疾病，高血糖可誘導、加重炎癥反應。炎癥反應是機體對于刺激的一種防御反應，通常情況下，炎癥反應對機體有益，是一種以防御為主的天然局部反應，具有消除損傷因子、防止病菌擴散、促進受損組織愈合的作用；在某些情況下，炎癥反應對機體有害，可作為某些疾病的病理生理基礎，促進疾病的發(fā)生發(fā)展，如特應性皮炎［7］等。高糖環(huán)境與炎癥反應密切相關(guān)，一方面高血糖可誘導、加重炎癥反應；另一方面，慢性炎癥反應可通過促進肝臟糖異生導致血糖生成過多，同時通過胰島素抵抗來抑制機體對血糖的攝取，促進高血糖進一步發(fā)生。MSCs最早在骨髓中發(fā)現(xiàn)，是一類屬于中胚層的多功能干細胞，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，其中以骨髓組織中最為豐富。研究表明，MSCs具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應、誘導移植耐受等功能［8］。以往研究認為，MSCs主要通過增殖、定向分化等途徑發(fā)揮其治療作用［9］；隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)MSCs還可通過調(diào)節(jié)炎癥反應、改善炎癥環(huán)境來實現(xiàn)其治療作用［10］。MSCs極易被高濃度炎癥相關(guān)因子吸引到組織損傷部位，其機制可能與MSCs受到炎癥環(huán)境信號刺激時釋放的抑制免疫反應分子促使其逃避免疫監(jiān)視，并遷移到損傷部位有關(guān)［11］。另有研究顯示，骨髓來源MSCs可通過其分泌的IL-6保護儲存池中的中性粒細胞，使其免于凋亡［12］。以上研究表明，MSCs可通過調(diào)控炎癥相關(guān)因子的釋放發(fā)揮其調(diào)節(jié)炎癥反應的作用。

人參皂苷Rg1是中藥人參的主要有效成分之一，具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫［13］、抗氧化應激［14］等作用。WU等［15］報道，負載人參皂苷Rb1/TGF-β1的絲素明膠多孔支架能夠促進大鼠骨髓來源MSCs向軟骨細胞分化，并抑制其炎癥基因表達。馬紅偉等［6］報道，對糖尿病皮膚潰瘍模型大鼠注入人參皂苷誘導分化骨髓間充質(zhì)干細胞懸液可顯著降低糖尿病皮膚潰瘍大鼠血清炎癥因子含量。本研究觀察了在高糖環(huán)境下受人參皂苷Rg1干預hUCBMSCs分泌炎癥相關(guān)因子IL-1、IL-6、IL-10、M-CSF、MCP-1的變化情況。IL-1是一種在炎癥反應中發(fā)揮重要作用的因子，主要由活化的的巨噬細胞所產(chǎn)生。IL-1生物學功能廣泛，可刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其免疫功能。此外，IL-1還具有促進其他炎癥因子表達，誘導中性粒細胞浸潤等功能［16］。IL-6是一種多功能細胞因子，在免疫反應、急性期反應及炎癥反應中發(fā)揮重要作用，其表達增加常見于多種炎癥性及腫瘤性疾病中［17］，常與IL-1共同參與炎癥反應［18］，并與IL-1共同作為炎癥指標之一。IL-10是一種免疫抑制因子，可通過抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質(zhì)，促進抗炎因子釋放來減輕炎癥反應，其在體內(nèi)最重要的來源是單核巨噬細胞和輔助T細胞［19］。M-CSF是一種具有譜系特異性的細胞因子，主要存在于骨髓腔內(nèi)，其主要作用是促進單核細胞的分化與增殖，并維持單核巨噬細胞的活性。發(fā)生炎癥反應時，由于炎癥細胞的浸潤，可激活機體產(chǎn)生大量M-CSF，同時M-CSF還可通過結(jié)合其受體引起單核巨噬細胞、內(nèi)皮細胞釋放更多M-CSF［20］。MCP-1是趨化因子C-C亞家族成員之一，具有趨化單核細胞、促進巨噬細胞浸潤、上調(diào)促炎因子釋放等功能［21］。

本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組細胞上清液中IL-1、IL-6、MCP-1水平顯著升高，表明高糖環(huán)境可誘導、加重炎癥反應，而MCP-1分泌增加可能與高糖誘導炎癥反應從而導致單核吞噬細胞系統(tǒng)細胞增生有關(guān)。經(jīng)人參皂苷Rg1干預后，干預組細胞上清液中抑炎因子IL-10水平升高，促炎因子IL-1、IL-6水平降低，同時M-CSF水平增加。這表明人參皂苷Rg1具有抗炎作用，而M-CSF分泌的增加可能與人參皂苷Rg1能與相應受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)單核巨噬細胞系細胞分化與增殖，從而參與炎癥反應有關(guān)［22］。這提示人參皂苷Rg1具有調(diào)控高糖誘導損傷hUCBMSCs分泌炎癥相關(guān)因子從而發(fā)揮抑制炎癥反應的作用。這一結(jié)果發(fā)展了人參皂苷Rg1具有調(diào)控炎癥反應的理論基礎，為后續(xù)研究人參皂苷Rg1調(diào)控炎癥反應的機制奠定了基礎。但是人參皂苷Rg1調(diào)控炎癥反應的具體作用機制尚不清楚，有待后期研究進一步挖掘。