朱婷，張?jiān)Ｃ瘢苟靼?，殷蘇威，劉欣悅，張萍

1青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院婦科，山東青島266011；2菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院生物檢測科；3青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院腎內(nèi)科

宮頸癌是女性最常見的癌癥之一。目前宮頸癌的治療方法包括手術(shù)、放化療以及聯(lián)合治療等，早期宮頸癌可通過根治性或保留生育能力的手術(shù)治療，5年生存率達(dá)80%以上，但仍有40%～50%的晚期患者體內(nèi)存在腫瘤的局灶復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［1］，療效較差。因此，開發(fā)新型高效、低毒的治療藥物用于復(fù)發(fā)難治性及晚期宮頸癌對改善患者預(yù)后具有重要意義。硫酸右旋糖苷（DS）是一種大分子右旋糖苷衍生物，具有來源廣、成本低、吸收緩慢、排泄快、安全性高、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)［2-3］。DS對胃癌細(xì)胞［4］、黑色素瘤細(xì)胞［5］、卵巢癌細(xì)胞［6］等多種惡性腫瘤具有明顯抑制作用，是一種具有潛力的抗癌藥物。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）即上皮細(xì)胞失去極性及細(xì)胞間黏附力，細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)的外觀和間質(zhì)特征，細(xì)胞由穩(wěn)定狀態(tài)變?yōu)榛钴S狀態(tài)，侵襲性和轉(zhuǎn)移性增加。EMT的標(biāo)志是上皮黏附分子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的丟失和間質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白（Vimentin）的獲得［7］。研究顯示，PI3K/AKT信號通路可以介導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于DS對宮頸癌作用的研究報(bào)道少見。2020年10月—2021年4月，我們觀察了DS對宮頸癌Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，并探討其作用機(jī)制與PI3K/AKT信號通路及EMT的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人宮頸癌Hela細(xì)胞株由青島大學(xué)附屬醫(yī)院青島市市立醫(yī)院細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DS購自北京索萊寶科技技術(shù)有限公司，用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。PI3K激動(dòng)劑740Y-P（美國MedChemExpressLLC公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)液（美國HyClone公司）；DMSO、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；單、多道微量移液器（德國Eppendorf公司）；0.25%胰酶-EDTA、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液、PVDF膜（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司）；SDS-凝膠配制試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；抗AKT一抗、抗β-actin一抗、熒光標(biāo)記二抗（美國Abcam公司）；抗p-AKT一抗（美國CST公司）；抗E-cadherin一抗、抗Vimentin一抗（北京Bioss公司）；Matrigel膠（美國Corning公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；低溫高速離心機(jī)、低速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)取Hela細(xì)胞，加入含10%胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素的DMEM中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，每1～2天換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 DS最佳作用濃度及作用時(shí)間的篩選采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，加入0.25%胰酶-EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，按5×103/孔接種于96孔板中。分別加入含0、0.1%、0.3%、0.6%、1.0%DS的DMEM完全培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)0、12、24、48 h后，于每孔中加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1 h。用酶聯(lián)免疫標(biāo)記分析儀于波長450 nm處測各孔吸光度值（OD值），代表細(xì)胞增殖情況。檢測結(jié)果見表1。與對照組相比，加入0.1%、0.3%、0.6%、1.0%DS后Hela細(xì)胞增殖活力下降，且隨作用時(shí)間延長，細(xì)胞增殖活力隨之下降（P均<0.05）。選擇能夠使細(xì)胞增殖活力降至約50%（即細(xì)胞增殖抑制率約50%）的DS濃度和作用時(shí)間作為最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即0.3%DS作用48 h。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05。

DS濃度（%）0 0.1 0.3 0.6 1.0 OD值0 h 0.527±0.005 0.529±0.007 0.519±0.008 0.516±0.006 0.520±0.007 12 h 0.841±0.033 0.810±0.035 0.694±0.013*0.653±0.015*0.619±0.007*24 h 1.073±0.026 0.972±0.053 0.858±0.044*0.738±0.011*0.669±0.018*48 h 2.223±0.056 1.471±0.039*1.169±0.054*1.030±0.041*0.922±0.032*

1.4 細(xì)胞分組與干預(yù)處理取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為對照組、DS組、DS+740Y-P組，對照組不加DS及740Y-P，DS組 加 入0.3% DS，DS+740Y-P組 加 入0.3%DS和20μmol/L 740Y-P，培養(yǎng)48 h。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取三組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按5×105/孔接種于6孔板中。當(dāng)細(xì)胞覆蓋孔底90%左右時(shí)，用10 μL移液槍頭沿底部垂直劃線，觀察0、48 h時(shí)的劃痕愈合情況并拍照，采用ImageJ_v1.8.0軟件進(jìn)行圖片分析，計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（劃痕后的即刻面積－劃痕后48 h的愈合面積）×100%/劃痕后的即刻面積。

1.5細(xì)胞侵襲能力觀察采用Transwell實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)基按1∶8的比例稀釋Matrigel，取100μL稀釋后的Matrigel，添加至每個(gè)小室的膜上，置于24孔板中，37℃孵育6 h使Matrigel聚合成凝膠。用無血清培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL。收集三組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，分別在Transwell小室的上室接種100μL細(xì)胞懸液，下室均加入600μL含20% FBS的完全培養(yǎng)基。置于24孔板中，37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。加入4%多聚甲醛溶液固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min。用濕棉簽小心擦去未穿過的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察小室濾膜底附著的細(xì)胞數(shù)。每組隨機(jī)選取5～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6 細(xì)胞AKT、p-AKT、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)檢測采用Western blotting法。收集三組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫5%牛奶封閉膜2 h。加入一抗（稀釋濃度分別為AKT 1∶1 000、p-AKT 1∶1 000、β-actin 1∶5 000、E-cadherin 1∶250、Vimentin 1∶1 000），4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL法顯色。以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，以p-AKT/AKT表示PI3K/AKT通路活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad8.3統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析及Dunnett'st檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞遷移能力比較對照組、DS組、DS+740Y-P組的細(xì)胞遷移率分別為43.48%±0.20%、23.19%±0.51%、40.61%±0.27%。與對照組相比，DS組細(xì)胞遷移率降低；與DS組比較，DS+740Y-P組細(xì)胞遷移率升高（P均<0.05）。

2.2 三組細(xì)胞侵襲能力比較對照組、DS組、DS+740Y-P組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（408.3±26.6）、（80.3±9.6）、（316.3±7.5）個(gè)。與對照組比較，DS組穿膜細(xì)胞數(shù)減少；與DS組比較，DS+740Y-P組穿膜細(xì)胞數(shù)增多（P均<0.05）。

2.3 三組細(xì)胞p-AKT/AKT、E-cadherin及Vimentin蛋白表達(dá)比較見表2。與對照組比較，DS組細(xì)胞p-AKT/AKT、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低，E-cad?herin蛋白表達(dá)水平升高（P均<0.05）；與DS組比較，DS+740Y-P組p-AKT/AKT、Vimentin蛋白表達(dá)水平升高，E-cadherin蛋白表達(dá)水平降低（P均<0.05）。

表2 三組細(xì)胞p-AKT/AKT、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 三組細(xì)胞p-AKT/AKT、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05，與DS組比較，#P<0.05。

組別對照組DS組DS+740Y-P組p-AKT/AKT 0.883±0.068 0.583±0.023*0.923±0.021#E-cadherin 0.621±0.013 0.812±0.025*0.659±0.019#Vimentin 0.728±0.015 0.564±0.015*0.685±0.016#

3 討論

晚期宮頸癌患者因腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而不能通過手術(shù)、放療進(jìn)行治療，且藥物治療選擇有限，其5年總生存率僅為5%～16%［8］。因有放、化療或手術(shù)史，再次治療較為困難，如何提高患者的治療效果、延長生存期、提高宮頸癌患者生活質(zhì)量成為目前臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。DS是一種大分子聚陰離子多糖，相對分子質(zhì)量為500 kD。研究表明，DS作為一種大分子右旋糖苷衍生物，對惡性腫瘤的發(fā)展存在明顯的抑制作用，因其優(yōu)點(diǎn)多，較傳統(tǒng)化療藥物相比，毒副作用輕微，被認(rèn)為是一種具有潛力的抗癌藥物。郭嘉欣等［9］報(bào)道，DS可減少M(fèi)2型巨噬細(xì)胞的浸潤數(shù)量，下調(diào)胃癌組織中血管內(nèi)皮生長因子及血管內(nèi)皮生長因子受體2的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制胃癌進(jìn)展。高文衛(wèi)等［4］研究表明，DS能夠抑制胃癌AGS、BGC-823、SGC-7901和GES-1細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。TAKAGI等［5］報(bào)道，DS處理B-16黑色素瘤細(xì)胞可以增加G1/G0期細(xì)胞比例，減少S和G2/M期細(xì)胞比例，表明DS通過阻止黑色素瘤細(xì)胞從G1到S期的轉(zhuǎn)變來抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制腫瘤進(jìn)展。但目前關(guān)于DS對宮頸癌作用的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，DS對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且隨時(shí)間延長和濃度增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。

遷移、侵襲能力的獲得是惡性腫瘤細(xì)胞的基本特征，也是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的決定性因素。腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要因素，是患者死亡的常見原因。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，DS組細(xì)胞遷移率降低，穿膜細(xì)胞數(shù)減少，表明DS能夠顯著抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌和惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞中存在PI3K/AKT信號通路的失調(diào)［10-12］?；罨腜I3K/AKT通過調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能所需的下游成分起作用，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、DNA損傷修復(fù)和血管生成［13］。在宮頸癌中存在AKT激酶的增強(qiáng)活化狀態(tài)，并且這種增強(qiáng)活化狀態(tài)與PI3KCA基因擴(kuò)增相關(guān)［14-15］。本研究結(jié)果顯示，DS組細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白相對表達(dá)量較對照組顯著降低，表明PI3K/AKT通路在DS抑制宮頸癌惡性行為中起關(guān)鍵作用。

EMT是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素，EMT標(biāo)記蛋白E-cadherin、Vimentin等被認(rèn)為是與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的標(biāo)志蛋白［16］。E-cadherin蛋白在維持細(xì)胞的形態(tài)和極性中起到了重要的作用，它的表達(dá)降低意味著腫瘤細(xì)胞的黏附力降低，侵襲和遷移潛能增大，易向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Vimentin蛋白負(fù)責(zé)維持細(xì)胞的完整性，其表達(dá)的增加可以促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更扁平、細(xì)長的間質(zhì)細(xì)胞形狀，增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲潛力［17］。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，DS組細(xì)胞中Vimentin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，表明DS通過上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白和下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，抑制了EMT的進(jìn)展，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。

研究顯示，PI3K/AKT信號通路可以介導(dǎo)EMT過程，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步驗(yàn)證DS是否通過抑制PI3K/AKT信號通路進(jìn)而抑制Hela細(xì)胞的惡性行為，我們采用PI3K激動(dòng)劑740Y-P與DS聯(lián)用處理Hela細(xì)胞，檢測Hela細(xì)胞p-AKT/AKT蛋白的相對表達(dá)及對Hela細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與DS組相比，DS+740Y-P組p-AKT/AKT、Vimentin蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞遷移率升高，穿膜細(xì)胞數(shù)增加，E-cadherin蛋白表達(dá)降低。這表明DS可通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路抑制EMT的進(jìn)展，從而抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移、侵襲等惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，DS具有抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的遷移、侵襲的作用，其機(jī)制可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路來抑制EMT進(jìn)程，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。通過本研究可以初步為晚期難治性宮頸癌的治療提供新的思路和藥物選擇。