張營慧，朱會芳，千新來

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河南新鄉(xiāng)453000

肝細胞癌（HCC）是常見的惡性腫瘤之一，其病 死率居惡性腫瘤的第二位［1］。近年來，盡管在HCC的防治方面已取得了一定程度的進展，但患者的長期生存情況仍然不佳［2］。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是HCC患者死亡的主要原因，而腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)系非常密切［3］。分子靶向治療是臨床治療腫瘤的新手段，在分子水平研究HCC的發(fā)病機制有助于尋找相應(yīng)的靶標(biāo)，提高HCC的臨床治療效果。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式通過調(diào)控基因的表達在多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用［4］。lncRNA異常在腫瘤生長、侵襲、遷移過程中發(fā)揮具有重要的調(diào)控功能，從而起到抑癌或促癌的作用［5-6］。SNHG1是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA家族成員之一，在非小細胞肺癌［7］、垂體瘤［8］、骨肉瘤［9］和胰腺癌［10］等惡性腫瘤細胞的進展中發(fā)揮重要作用。研究顯示，SNHG1高表達可促進非小細胞肺癌［7］、骨肉瘤細胞［9］以及垂體瘤細胞［8］的遷移。但是，目前關(guān)于SNHG1在HCC細胞侵襲和遷移中作用及機制的研究少見。2020年1月—2021年3月，我們采用siRNA技術(shù)干擾HCC細胞中SNHG1的表達，觀察其對細胞侵襲和遷移能力的影響，并探討其作用機制與EMT的關(guān)系，旨在為HCC的分子治療提供新的靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料人正常肝細胞L02和人HCC細胞HepG2、SMMC7721，由本實驗室自主保存。10%胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、100 mg/mL青霉素以及鏈霉素均購自美國Gibco公司；Transwell小室購自Corning公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Master Mix試劑盒均購自日本Takara公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自蘇州宇恒生物科技有限公司；引物合成、SNHG1 siRNA及NC siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成；RIPA裂解液、BCA試劑購自南京凱基生物公司；α-Tublin單克隆抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）抗體購自英國Abcam公司；SDS-PAGE、PVDF膜和ECL發(fā)光試劑盒購自美國Merk公司。

1.2 正常肝細胞和HCC細胞培養(yǎng)將L02、HepG2、SMMC7721細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合度達到80%以上，進行傳代。

1.3 正常肝細胞和HCC細胞中SNHG1表達檢測采用qRT-PCR法。取對數(shù)生長期細胞，使用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA，分光光度計測量RNA濃度及純度，取1μg RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SYBR Master Mix試劑盒說明書，進行qPCR檢測。引物序列：SNHG1上游5′-GGGG?TACCGTTCTCATTTTTCTACTGCTCGTG-3′，下游5′-CGGGATCCATGTAACAACATTTTATTATTTTCATC-3′，GAPDH上 游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下 游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 HCC細胞分組與轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的HepG2和SMMC7721細胞，接種于6孔板中進行培養(yǎng)。將兩種細胞各分為兩組，干擾組和對照組。使用Opti-MEM分別孵育siRNA干擾片段、NC片段及Lipofectamine3000，混勻后靜置5 min。然后將Lipo?fectamine3000與Opti-MEM的混合液分別加入siRNA混懸液以及NC混懸液中，混勻后靜置20 min。之后分別加入HepG2和SMMC7721細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞。采用qRT-PCR法檢測細胞中SNHG1表達，步驟同“1.3”。結(jié)果顯示HepG2細胞干擾組和對照組SNHG1的相對表達量分別為1.036±0.021、0.254±0.033，SMMC7721細胞干擾組和對照組SNHG1的相對表達量分別為1.009±0.014、0.476±0.072。兩種細胞干擾組SNHG1表達均較對照組降低（P均<0.05），表明干擾成功。

1.5 HCC細胞侵襲能力觀察采用Transwell實驗。取各組轉(zhuǎn)染后的細胞，加入胰酶消化，制成單細胞懸液。在Transwell小室的的上室中接種200 μL含1×105個 細 胞；用500 μL含10%胎 牛 血 清 的DMEM完全培養(yǎng)基作為趨化因子置于下室，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h；加入4%多聚甲醛固定30 min，蘇木素染色30 min，在正置光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個高倍視野進行計數(shù)、拍照，取其均值代表侵襲細胞數(shù)量。

1.6 HCC細胞遷移能力觀察采用細胞劃痕實驗。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化并計數(shù)，將細胞按5×105/孔鋪入6孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。待細胞生長至融合率達約90%時，用10 μL無菌槍頭劃板，輕搖并吸去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗3次，去掉漂浮的細胞。倒置顯微鏡10倍視野下取點，分別記錄劃痕后0和24 h劃痕寬度的變化，用Image J軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（24 h劃痕寬度－0 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 HCC細胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimen?tin檢測采用Western blotting法。取對數(shù)生長期HCC細胞，加入RIPA裂解液，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣30 μg蛋白質(zhì)，SDS-PAGE結(jié)束后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h。分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜；HRP偶聯(lián)的辣根過氧化物酶二抗孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光。定影后用Image J軟件分析條帶光密度。以α-Tublin作為內(nèi)參，計算目的蛋白與α-Tublin光密度比值，表示目的蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，HCC細胞與正常肝細胞中SNHG1表達的比較采用配對樣本t檢驗，干擾SNHG1表達后細胞侵襲和遷移能力、EMT相關(guān)蛋白表達比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常肝細胞和HCC細胞SNHG1表達比較L02、HepG2、SMMC7721細胞SNHG1相對表達量分別為1.01±0.21、3.056±1.98、4.22±1.64，HepG2、SMMC7721細胞SNHG1表達均高于L02細胞（P均<0.05）。

2.2 干擾SNHG1表達對HCC細胞侵襲和遷移能力的影響與對照組比較，干擾組HepG2和SMMC7721細胞的穿膜細胞數(shù)、細胞遷移率均降低（P均<0.05）。見表1。

表1 HepG2和SMMC7721細胞轉(zhuǎn)染后細胞侵襲和遷移能力的影響（±s）

表1 HepG2和SMMC7721細胞轉(zhuǎn)染后細胞侵襲和遷移能力的影響（±s）

注：與對照組同類型細胞比較，*P<0.05。

組別干擾組HepG2 SMMC7721對照組HepG2 SMMC7721穿膜細胞數(shù)（個）99.26±15.12*142.75±20.66*286.57±45.22 309.15±68.37細胞遷移率（%）32.44±9.88*40.26±10.26*58.14±10.22 86.59±11.34

2.4 干擾SNHG1表達對HCC細胞EMT相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，干擾組HepG2和SMMC7721細胞中Vimentin表達減少，而E-cadherin表達增加（P均<0.05）。見表2。

表2 HepG2和SMMC7721細胞轉(zhuǎn)染后Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

表2 HepG2和SMMC7721細胞轉(zhuǎn)染后Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

注：與對照組同類型細胞比較，*P<0.05。

組別干擾組HepG2 SMMC7721對照組HepG2 SMMC7721 E-cadherin蛋白6.255±0.698*3.624±0.858*2.642±0.061 1.052±0.027 Vimentin蛋白2.532±0.055*1.339±0.017*4.873±0.989 4.002±0.791

3 討論

HCC是目前世界上病死率最高的惡性腫瘤之一，也是我國發(fā)病率和病死率位居前列的腫瘤之一。盡管在HCC的臨床治療方面做出了巨大的努力，但由于腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，HCC患者的總體生存率并沒有提高。因此，研究其侵襲與遷移的分子機制，將為臨床治療HCC提供新的理論靶點。lncRNA是指長度超過200 nt、無或編碼蛋白潛力有限的RNA轉(zhuǎn)錄本，它們可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后不同層次調(diào)控基因的表達水平。lncRNA可通過不同的分子調(diào)控機制參與HCC的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，lncRNA MALAT1通過上調(diào)剪接因子SRSF1，促進HCC的 惡 性 表 型 轉(zhuǎn) 化［11］；lncRNA SNHG3通過miR-128/CD151級聯(lián)激活誘導(dǎo)肝癌細胞EMT轉(zhuǎn)化，并且SNHG3高表達與患者生存率降低以及化療藥物抵抗有關(guān)［12］。本研究結(jié)果顯示，SNHG1在HCC細胞HepG2和SMMC7721中的表達均高于正常肝細胞，表明SNHG1與HCC的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。

為了進一步探討SNHG1在HCC中的作用及機制，本研究以HCC細胞系胞HepG2和SMMC7721為研究對象，通過干擾細胞中SNHG1表達，觀察其對HCC細胞侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果顯示，干擾SNHG1表達后，HepG2和SMMC7721細胞的侵襲和遷移能力均顯著下降，表明SNHG1能夠促進HCC細胞的侵襲和遷移能力，證明其具有促癌作用。

EMT是指上皮細胞通過特定的生理或病理條件向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變的過程，這一過程參與了組織胚胎發(fā)育及形成、器官分化及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等重要的生理病理過程。在上皮腫瘤細胞EMT過程中，伴隨有細胞骨架以及相關(guān)表型基因的改變。例如，上皮標(biāo)志物E-cadherin的減少和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的增加，使細胞緊密連接、極性丟失和間充質(zhì)細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致腫瘤細胞黏附作用減弱而運動能力增強，從而獲得更強的侵襲和遷移能力［13-15］。本 研 究 結(jié) 果 顯 示，干 擾 組HepG2和SMMC7721細胞間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達減少，而上皮標(biāo)志物E-cadherin表達增加。這表明lncRNA SNHG1可增強HCC細胞的侵襲及遷移能力，可能與其調(diào)控E-cadherin和Vimentin蛋白表達，從而促進EMT形成有關(guān)。然而，SNHG1如何調(diào)控EMT相關(guān)蛋白表達的具體機制尚不明確，有待進一步深入研究。

綜上所述，lncRNA SNHG1在HCC細胞中呈高表達，并通過調(diào)控HCC細胞的EMT表型改變進而促進HCC細胞的侵襲與遷移能力，從而參與HCC的發(fā)生發(fā)展。本研究初步探明了lncRNA SNHG1在HCC侵襲與遷移中的功能及機制，為HCC的診療提供了新的靶標(biāo)。