劉明麗 金鳳梅 周靜江 曹宇霏 馬清杰 王尉 劉哲 陳利娜 閻澤君

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是一種嚴(yán)重威脅人類安全的病原體，能特異性攻擊人體免疫系統(tǒng)(特別T淋巴系統(tǒng))，造成人體免疫系統(tǒng)不可逆性缺陷，誘發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染及腫瘤發(fā)生率，嚴(yán)重影響患者身心健康和生命安全[1,2]。其常見(jiàn)傳播途徑包括性接觸傳播、血液傳播、母嬰傳播，血液傳播是HIV傳播的主要途徑，如何降低輸血傳染性殘余風(fēng)險(xiǎn)、保障輸血使用安全，是全社會(huì)共同關(guān)注的問(wèn)題[3]。因HIV檢測(cè)“窗口期”較長(zhǎng)、病毒變異、免疫靜默感染等因素的影響，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linded immunosorbent assays,ELISA)檢測(cè)有“弱陽(yáng)性標(biāo)本”漏檢的風(fēng)險(xiǎn)[4,5]。核酸檢測(cè)(nucleic acid test,NAT)通過(guò)擴(kuò)增靶核酸或其攜帶的特異性DNA或RNA片段，可將極微量的核酸轉(zhuǎn)化為直觀的光電等可視信號(hào)，能有效縮短病毒檢測(cè)“窗口期”，提高檢測(cè)效能[6,7]。ELISA、NAT聯(lián)合篩查已成為我國(guó)采供血機(jī)構(gòu)HIV的篩查策略，能夠提高HIV檢出率、減少血液資源浪費(fèi)、保障輸血安全[8,9]。本文通過(guò)回顧性分析2018至2019年承德市中心血站77 886例無(wú)償獻(xiàn)血者血液樣本相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，以蛋白印跡法(westem blot,WB)為“金標(biāo)準(zhǔn)”，探討ELISA、NAT在檢測(cè)HIV中的應(yīng)用價(jià)值，旨在為基層中心血站HIV檢測(cè)提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 調(diào)查對(duì)象 回顧性分析2018至2019年承德市中心血站77 886例無(wú)償獻(xiàn)血者血液樣本相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，所有獻(xiàn)血者健康體檢符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)等《BG18467-2011獻(xiàn)血者健康檢查要求》[10]標(biāo)準(zhǔn)。男46 594例，女31 292例；年齡21～56歲，平均(35.64±6.12)歲。其中初次獻(xiàn)血者49 675例，≥2次獻(xiàn)血者28 211例。

1.2 標(biāo)本采集 每位獻(xiàn)血者采集3管5 ml血液標(biāo)本，4 h內(nèi)3 000 r/min離心10 min取血清，保存于2℃～8℃下，72 h完成相關(guān)檢測(cè)。

1.3 試劑與儀器 (1)第3代ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司，第4代ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司，NAT檢測(cè)試劑上海科華生物工程有限公司；WB試劑盒購(gòu)自新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人公司。(2)離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司Sigma-6K15型；全自動(dòng)加樣儀：瑞士HAMILTON公司STAR 8CH型；全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)：瑞士MAMILTON公司FAME24/20、FAME24/30、深圳愛(ài)康Uranus AE 280；核酸檢測(cè)系統(tǒng)：瑞士HAMILTON公司STAR提取系統(tǒng)、ABI7500擴(kuò)增儀。

1.4 檢測(cè)方法 (1)血清學(xué)檢測(cè)：采用第3代、第4代ELISA進(jìn)行HIV抗原或抗體檢測(cè)，兩種ELISA檢測(cè)試劑均呈無(wú)反應(yīng)性則判定該標(biāo)本為ELISA無(wú)反應(yīng)性。任意1種試劑呈陽(yáng)性反應(yīng)，采用該試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試，雙孔復(fù)試均有陽(yáng)性反應(yīng)或單孔有陽(yáng)性反應(yīng)，則判定為ELISA反應(yīng)性；如2種試劑均呈陽(yáng)性反應(yīng)性則判定為ELISA反應(yīng)性。(2)病毒核酸檢測(cè)：采用PCR-熒光法進(jìn)行核酸檢測(cè)，檢測(cè)模式采用混樣-折分模式或單樣本檢測(cè)。如混樣出現(xiàn)反應(yīng)性則進(jìn)行拆分檢測(cè)，若仍有反應(yīng)性且ELISA有反應(yīng)，則送至承德市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行WB確認(rèn)，若仍有反應(yīng)性且ELISA無(wú)反應(yīng)性，則進(jìn)行追蹤檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或率表示，采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA、NAT檢測(cè)反應(yīng)性及WB確證結(jié)果分析 77 886份樣本中，第3代ELISA單試劑反應(yīng)性35例，反應(yīng)率0.45‰；第4代ILISA單試劑反應(yīng)性41例，反應(yīng)率0.57‰；第3、4代ELISA雙試劑反應(yīng)性28例，反應(yīng)率0.36‰；NAT反應(yīng)31例，反應(yīng)率0.40‰；WE確證29例，確證率0.37‰。見(jiàn)表1。

表1 2018至2019年無(wú)償獻(xiàn)血者ELISA、NAT檢測(cè)反應(yīng)及WB確證結(jié)果 例(‰)

2.2 NAT反應(yīng)性與ELISA檢測(cè)單雙反應(yīng)性符合率分析 NAT與第3代、4代ELISA單試劑與雙試劑反應(yīng)性有良好的陽(yáng)性及陰性符合率。見(jiàn)表2。

表2 NAT反應(yīng)性與與ELISA檢測(cè)單反應(yīng)性、雙反應(yīng)比較 例

2.3 NAT反應(yīng)與ELISA檢測(cè)總反應(yīng)性分析 107例反應(yīng)性樣本中，NAT檢出31例，ELISA檢出104份。其中NAT在ELIAS無(wú)反應(yīng)性樣本中檢出3例，WB確認(rèn)2例，ELIAS檢測(cè)HIV殘余風(fēng)險(xiǎn)為1：38943。NAT(+)ELISA(+)、NAT(+)ELISA(-)檢出率高于ELISA(+)NAT(-)檢出率(χ2=89.204,33.739,P<0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 NAT反應(yīng)性與ELISA檢測(cè)總反應(yīng)性比較 例

2.4 ELISA單反應(yīng)性及NAT反應(yīng)性檢測(cè)效果分析 以WB確證結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，第3代ELISA單反應(yīng)靈敏度、特異度分為為82.7586%、99.9859%，第4代ELISA單反應(yīng)靈敏度、特異度分別為86.2069%、99.9794%，NAT反應(yīng)性靈敏度、特異度分別為96.5517%、99.9961%。NAT反應(yīng)性靈敏度高于第3代ELISA單反應(yīng)靈敏度(χ2=4.062,P<0.05)，特異度高于第3代、第4代反應(yīng)特異度(χ2=5.401,8.896,P<0.05)。見(jiàn)表5。

表4 NAT與ELISA檢測(cè)反應(yīng)者驗(yàn)證結(jié)果 例

表5 ELISA單反應(yīng)性與NAT反應(yīng)性檢測(cè)效果

3 討論

我國(guó)無(wú)償獻(xiàn)血人數(shù)和采血量已保持連續(xù)23年增長(zhǎng)，2018年獻(xiàn)血人次高達(dá)1 500萬(wàn)[11]，如何保證血液安全特別是血液本身質(zhì)量的安全，是全社會(huì)共同關(guān)注的問(wèn)題。血液傳播是各類傳染病感染的一種重要途徑，輸血也成為傳染病傳播的一種特殊方式。加強(qiáng)無(wú)償獻(xiàn)血者血液篩查力度，能夠有效防范因輸血罹患傳染病的風(fēng)險(xiǎn)[12]。我國(guó)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》[13]檢測(cè)策略明確要求，HIV感染標(biāo)志物應(yīng)至少各進(jìn)行1次核酸、血清學(xué)檢測(cè)，抗HIV陰性血液才可以應(yīng)用于臨床。

ELISA為免疫學(xué)經(jīng)典檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，將可溶性抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體表面，借助抗原抗體特異性免疫反應(yīng)，進(jìn)行定性定量檢測(cè)。ELISA是血液HIV感染常用篩查方法，廣泛應(yīng)用于我國(guó)各級(jí)中心血站血液檢測(cè)中。其特點(diǎn)是檢測(cè)快速、靈敏度較高、費(fèi)用較低。盡管ELISA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代，但檢測(cè)HIV抗體“窗口期”仍為22 d[14,15]。ELISA檢測(cè)目標(biāo)為血液中病毒抗原，如果病毒仍處于“窗口期”，ELISA難以進(jìn)行有效檢測(cè)，HIV“窗口期”較長(zhǎng)，ELISA檢測(cè)易出現(xiàn)漏診風(fēng)險(xiǎn)[16]。同時(shí)病毒滴度、免疫沉默性感染、病毒變異等各種因素的影響，ELISA檢測(cè)仍存在輸血相關(guān)感染的風(fēng)險(xiǎn)。本文研究中，77 779份ELIAS無(wú)反應(yīng)性樣本中，NAT檢出3例，WB確認(rèn)2例，ELIAS檢測(cè)HIV殘余風(fēng)險(xiǎn)為1∶38 943。低于吳敬林等[17]報(bào)道的1∶32 605(廣西柳州)，高于陳艷萍[18]報(bào)道的1∶67 307(深圳地區(qū))，可能與不同地區(qū)HIV感染情況、獻(xiàn)血人群組成、數(shù)據(jù)采集時(shí)間段等因素有關(guān)，但能夠說(shuō)明因HIV感染“窗口期”較長(zhǎng)，ELISA檢測(cè)易發(fā)生漏檢，仍有輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn)發(fā)生的可能。

NAT也稱病毒核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用DNA“高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸”的變化規(guī)律，95℃變性為單鏈，60℃左右引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)，72℃(DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度)DNA聚合酶沿磷酸到五碳糖方向合成互補(bǔ)鏈?？墒笵NA迅速擴(kuò)增，極大縮短檢測(cè)窗口期(22 d縮短為11 d)[19]。利用物理、化學(xué)、生物學(xué)等方法，直接擴(kuò)增靶核酸或攜帶的特異性DNA或RNA片段，使肉眼不可見(jiàn)的極微量核酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^光電或可視信號(hào)，以檢測(cè)標(biāo)本中是否存在相應(yīng)病原體[20]。不論是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)、核酸序列依賴擴(kuò)增(NASBA)，均能夠至少縮短HIV感染“窗口期”7 d以上，這樣可以篩查早期急性病毒感染的獻(xiàn)血者，進(jìn)一步降低經(jīng)輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)[21,22]。而且NAT反應(yīng)性、ELISA反應(yīng)性與WB確認(rèn)有良好的符合關(guān)系[23]。本文研究中，NAT(+)ELISA(+)檢出符合率92.86%(26/28)、NAT(+)ELISA(-)檢出符合率66.67%(2/3)高于ELISA(+)NAT(-)檢測(cè)符合率1.32%(1/77)(χ2=89.204,33.739,P<0.05)。所得結(jié)論也支持上述文獻(xiàn)觀點(diǎn)。

進(jìn)一步分析表明，77 886份樣本中，第3代ELISA反應(yīng)性35例，第4代ILISA反應(yīng)性41例，第3、4代ELISA雙反應(yīng)性28例，NAT反應(yīng)31例。以WE確證(29例)為金標(biāo)準(zhǔn)，第4代ELISA靈敏度86.2069%略高于第3代ELISA 82.7586%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與何成濤等[24]文獻(xiàn)報(bào)道基本相似。同時(shí)NAT反應(yīng)性靈敏度96.5517%高于第3代ELISA 82.7586%，特異度99.9961%高于第3代ELISA 99.9859%、第4代ELISA 反應(yīng)99.9794%(P<0.05)。湛玉武[25]也有類似的文獻(xiàn)報(bào)道，說(shuō)明NAT篩查HIV效能優(yōu)于ELISA。需要指出的，NAT檢測(cè)對(duì)象為RNA，RNA提取與保存是最難控制的環(huán)節(jié)，操作過(guò)程中易受到污染，極其微量的污染就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性率和復(fù)測(cè)無(wú)反應(yīng)性等問(wèn)題[26,27]。因此建議基層血站在篩查HIV感染中，盡量采用ELISA聯(lián)合NAT檢測(cè)，以提高診斷檢測(cè)準(zhǔn)確率。

相關(guān)研究表明，NAT與ELISA在血液篩查中有較好的互補(bǔ)性[28,29]。(1)ELISA以病原體抗原、抗體為檢測(cè)對(duì)象，病毒進(jìn)入體內(nèi)產(chǎn)生能夠檢測(cè)的抗體需要較長(zhǎng)時(shí)間，明顯延長(zhǎng)了檢測(cè)窗口期。NAT技術(shù)以病原體核酸為檢測(cè)對(duì)象，可縮短窗口期漏檢誤檢風(fēng)險(xiǎn)。(2)外周血中病原存在間歇性現(xiàn)象導(dǎo)致病毒載量降低，若低于NAT檢出水平，也會(huì)導(dǎo)致NAT漏檢風(fēng)險(xiǎn)。而窗口期延長(zhǎng)病毒感染會(huì)增加血液中抗體或抗原體滴度，不會(huì)影響ELISA檢出水平[30,31]。(3)抗體需要免疫應(yīng)答才能產(chǎn)生，當(dāng)機(jī)體對(duì)病原體刺激無(wú)應(yīng)答反應(yīng)時(shí)，會(huì)增加相應(yīng)抗體ELISA漏檢的風(fēng)險(xiǎn)。NAT以病原體核酸為檢測(cè)對(duì)象，不受免疫靜默感染的影響[32]。(4)ELISA通過(guò)抗原體反應(yīng)識(shí)別“靶目標(biāo)”，NAT依靠引物與探針識(shí)別“靶目標(biāo)”，二者均難以保證病毒變異的檢出率[33]。也就是說(shuō)，ELISA、NAT在HIV篩查中均由自己的局限性，同時(shí)兩種方法也有良好的互補(bǔ)性，這也NAT聯(lián)合ELISA能夠提高HIV檢出率的理論基礎(chǔ)。

本文研究結(jié)果表明，NAT反應(yīng)性、ELISA反應(yīng)性與WB確證有良好的符合關(guān)系，NAT檢測(cè)能夠縮短檢測(cè)“窗口期”，與ELISA平行檢測(cè)能夠降低HIV殘余風(fēng)險(xiǎn)，保障輸血使用安全性。需要指出的是，本文僅為單中心回顧性研究，也未對(duì)ELISA單反應(yīng)性、雙反應(yīng)性殘余風(fēng)險(xiǎn)的分析，同時(shí)也未進(jìn)行ELISA、NAT聯(lián)合檢測(cè)HIV的比較。需要后續(xù)擴(kuò)大樣本、進(jìn)行多中心前瞻性研究，以獲取更客觀、更有說(shuō)服力的結(jié)論，為基層血站制定血液檢測(cè)策略提供參考。