吳園園 潘艷艷 蔡紅嬌 紀(jì)軍 張利

遼寧省大連市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 116033

傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）是兒童時(shí)期常見(jiàn)的急性增生性疾病，由EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染引起，臨床以發(fā)熱、頭痛、咽峽炎、皮疹、非典型性淋巴細(xì)胞增多、淋巴結(jié)與肝脾腫大以及出現(xiàn)異性淋巴細(xì)胞為特征，除了EBV外，其他病原體也可以引起類似臨床癥狀的綜合征，為傳染性單核細(xì)胞綜合征（IMS）。雖然致病原不一，然而IMS與IM的臨床癥狀極為相似。IM一年四季均可發(fā)病，早期癥狀不典型，臨床表現(xiàn)多樣性，故在早期容易出現(xiàn)誤診或是漏診而導(dǎo)致嚴(yán)重后果［1］。目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)EBV所致的IM有較深的認(rèn)識(shí)，EBV為常見(jiàn)的皰疹病毒，感染人體后主要宿主細(xì)胞是B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞可以表達(dá)很多EBV特異性抗原分子，而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗原的特異性免疫應(yīng)答［2］。EBV感染引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)［3］，而對(duì)于IMS知之甚少，與IM患兒程序性死亡受體1（PD-1）以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的比較還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析40例IM患兒實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指標(biāo)，尤其是免疫細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況以及Tregs數(shù)量，和IMS患兒進(jìn)行比較，為IM與IMS的診斷和患兒免疫調(diào)節(jié)干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2019年9月大連市中心醫(yī)院兒科收治的40例IM患兒為IM組，均符合《褚福堂實(shí)用兒科學(xué)（第8版）》［4］中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)。以同期收治的40例IMS患兒為對(duì)照，EBV DNA檢測(cè)為陰性。

1.2 外周血EBV DNA檢測(cè) 采集兩組EDTA-K2抗凝外周血2 ml，取1 ml采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，提取DNA，然后應(yīng)用EBV核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（達(dá)安公司）定量檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞EBV DNA含量，使用的實(shí)時(shí)熒光PCR儀器為ABIViia7。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 采集患者EDTA-K2抗凝外周血2 ml，檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+），CD4+T和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平以及Tregs的百分?jǐn)?shù)。所有抗體均購(gòu)自美國(guó)BECKMAN COULTER。使用了以下這 些 抗 體：FITC-CD4、PE-CD8、PC5-CD3、FITC-CD8、PE-PD-1、PC5-CD4、FITC-CD4、PE-CD127、PC5-CD25。每100μl EDTA抗凝外周血加入20μl單克隆抗體，混勻并于暗處室溫孵育20 min。外周血加入1.0 ml溶血素，混勻，暗處室溫放置10 min。420×g離心5 min，棄上清，加入1 ml 1×PBS上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECKMAN COULTERFC500。

1.4 外周血免疫球蛋白和補(bǔ)體水平檢測(cè) 采集患者外周血2 ml，凝固后1 710×g離心5 min，分離血清采用散射比濁法檢測(cè)血清免疫球蛋白G（IgG）、IgM、IgA，補(bǔ)體C3和C4水平。

1.5 外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 采集患者EDTA-K2抗凝外周血2 ml，使用希森美康XE-2100進(jìn)行外周血細(xì)胞分類檢測(cè)，用奧林巴斯顯微鏡進(jìn)行異型淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算出異型淋巴細(xì)胞百分比。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)，使用（±s）表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，計(jì)量資料不呈正態(tài)分布時(shí)（如異型淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)），使用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 IMS組男24例，女16例，年齡（5.11±4.07）歲；IM組男22例，女18例，年齡（8.33±5.32）歲；兩組患兒臨床資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 外周血EBV DNA含量檢測(cè) 檢測(cè)兩組患兒外周血EBV DNA含量，IM組EBV DNA含量為18.45（4.73，103.33）×105copies/ml，IMS組EBV DNA含量為0。

2.3 白細(xì)胞數(shù)量比較 檢測(cè)兩組患兒外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值。研究發(fā)現(xiàn)IM組白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和絕對(duì)值都明顯高于IMS組。同時(shí)檢測(cè)異型淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，IM組明顯高于IMS組。見(jiàn)表1。

表1 兩組患兒白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和異型淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)比較

2.4 抗體和補(bǔ)體的檢測(cè) 檢測(cè)外周血IgG、IgM、IgA水平，發(fā)現(xiàn)IgG和IgA水平在IM組明顯升高，而IgM水平在IM組有所升高但是兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。天然免疫系統(tǒng)分子補(bǔ)體C3和C4在IM組出現(xiàn)明顯降低。見(jiàn)表2。

表2 兩組患兒外周血抗體和補(bǔ)體水平比較（mg/dl，±s）

表2 兩組患兒外周血抗體和補(bǔ)體水平比較（mg/dl，±s）

注：IMS為傳染性單核細(xì)胞綜合征，IM為傳染性單核細(xì)胞增多癥，Ig為免疫球蛋白

組別IMS組IM組t值P值例數(shù)40 40補(bǔ)體C3 103.85±13.01 85.52±8.53-3.722 0.001補(bǔ)體C4 28.36±6.81 20.84±1.31-4.392＜0.001 IgG 874.46±222.10 1 314.86±408.14 4.405＜0.001 IgM 116.87±40.51 165.31±85.07 1.363 0.182 IgA 109.24±73.26 206.53±81.31 5.003＜0.001

2.5 T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比較 檢測(cè)了外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。發(fā)現(xiàn)IM組CD3+CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯低于IMS組（t=-13.752，P＜0.001），而CD3+CD8+T細(xì)胞和總CD3+T細(xì)胞明顯高于IMS組（t=-11.694，P＜0.001；t=-3.290，P=0.002），見(jiàn)圖1。

圖1 40例傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）與40例傳染性單核細(xì)胞綜合征（IMS）患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分?jǐn)?shù)比較。A為CD3+CD4+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與流式圖，B為CD3+CD8+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與流式圖，C為CD3+T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與流式圖

2.6 Tregs百分?jǐn)?shù)檢測(cè) 對(duì)具有免疫調(diào)節(jié)功能的Tregs進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IM組Tregs數(shù)量明顯低于IMS組（t=9.742，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

圖2 40例傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）與40例傳染性單核細(xì)胞綜合征（IMS）患兒外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）百分?jǐn)?shù)檢測(cè)。A為Tregs百分?jǐn)?shù)，B為Tregs代表流式圖

2.7 PD-1表達(dá)分析 檢測(cè)兩組患兒外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)IM組CD8+PD-1+細(xì)胞和總PD-1+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)均明顯高于IMS組（t=9.288，P＜0.001；t=7.959，P＜0.001），而CD4+PD-1+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.177，P=0.860），見(jiàn)圖3。

圖3 40例傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）與40例傳染性單核細(xì)胞綜合征（IMS）患兒外周血程序性死亡受體1（PD-1）表達(dá)分析。A為CD4+PD-1+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與細(xì)胞代表流式圖，B為CD8+PD-1+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與細(xì)胞代表流式圖，C為PD-1+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)與細(xì)胞代表流式圖

3 討 論

IM是兒童時(shí)期常見(jiàn)的感染性疾病之一，B細(xì)胞是EBV感染的靶細(xì)胞［5］。IM發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，免疫功能的改變?cè)贗M中B細(xì)胞的增殖和清除病毒方面發(fā)揮重要作用［6］，但是IM的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，導(dǎo)致其免疫失衡的具體機(jī)制尚未完全明了。IMS是非EBV感染所致，疾病初期臨床癥狀與IM極為相似。本研究發(fā)現(xiàn)IM組外周血CD3+CD8+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD3+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、CD8+PD-1+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、PD-1+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、異型淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、抗體水平都較IMS組明顯升高，而CD3+CD4+T細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、Tregs細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和補(bǔ)體水平較對(duì)照組明顯降低。

國(guó)內(nèi)外的諸多研究都表明了IM急性期存在CD3+CD4+T細(xì)胞明顯降低而CD3+CD8+T細(xì)胞明顯升高［7］，本研究也得到相似的結(jié)果。這是由于B淋巴細(xì)胞表面具有EBV受體，B淋巴細(xì)胞感染后增生活躍，其抗原性發(fā)生改變，后者可引起T淋巴細(xì)胞防御反應(yīng)，形成細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞直接破壞受染的B細(xì)胞［8］。

在感染性疾病中Tregs在調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，既能有效清除外來(lái)病原體又能有效控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度而不至于引起嚴(yán)重的組織損傷［9］。本研究發(fā)現(xiàn)了Tregs在IM組出現(xiàn)明顯的下降，這表明IM感染中Tregs的抑制功能有所下降，可能有利于T細(xì)胞對(duì)病原體特異性抗原的反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞克隆擴(kuò)增，大量的T細(xì)胞增殖，這可能是CD8+T細(xì)胞出現(xiàn)明顯增加的原因，導(dǎo)致IM患兒免疫失衡。

PD-1是一種T細(xì)胞抑制性受體，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)的重要抑制分子，在免疫應(yīng)答的適時(shí)終止中扮演著極其重要的角色［10］。PD-1不但在慢性感染中發(fā)揮作用［11］，在急性感染中也同樣發(fā)作用［12］。通常在非持續(xù)性的病毒感染中，PD-1表達(dá)是下調(diào)的，以控制感染和加速病毒的清除。在本研究中發(fā)現(xiàn)IM組CD8+PD-1+和PD-1+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于IMS組，并且和EBV DNA含量有明顯的相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道，在急性感染中，高水平的PD-1表達(dá)主要是由于T細(xì)胞受體的持續(xù)活化［13］，反饋導(dǎo)致PD-1的高水平表達(dá)［14］。

除了細(xì)胞免疫功能的改變，IM組體液免疫功能也出現(xiàn)明顯的改變，血清抗體水平明顯高于IMS組［15］。自然免疫系統(tǒng)補(bǔ)體C3和C4的含量在IM患兒體內(nèi)卻明顯減少，補(bǔ)體系統(tǒng)的存在使宿主能以相對(duì)非特異性的方式對(duì)微生物入侵立即進(jìn)行抵抗［16］。補(bǔ)體激活通常對(duì)機(jī)體有益，但是由于IM患兒體內(nèi)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)，補(bǔ)體可能被消耗，而C3和C4出現(xiàn)明顯的下降。

綜上所述，本研究表明IM患兒較IMS患兒Tregs明顯降低，而PD-1在CD8+T細(xì)胞上的表達(dá)卻明顯增強(qiáng)，這為IM的診斷和患兒免疫調(diào)節(jié)干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。