侯文肖，吳依娜，叢魯紅，李 濤，張洪春，段 軍★

（1.中日友好醫(yī)院 外科重癥醫(yī)學科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學 研究生院，北京100029；3.中日友好醫(yī)院 教育處，北京 100029；4.中日友好醫(yī)院 保健醫(yī)療部，北京 100029）

近年來，空氣環(huán)境污染對人類健康的影響越來越大，尤其是大氣顆粒物的影響已成為一個嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[1]。并且在過去的幾十年里，很多證據(jù)表明大氣顆粒物能夠誘發(fā)、加劇呼吸道疾病，如哮喘、慢阻肺、肺纖維化、甚至癌癥[2，3]。其實，細顆粒物（PM2.5）是能夠引起氣道傷害的主要空氣污染物[4]。它可以通過影響機體免疫系統(tǒng)導致炎性介質(zhì)的過度釋放及炎性因子聚集，產(chǎn)生炎性反應擾亂肺組織局部微環(huán)境的穩(wěn)定，進而造成組織損傷并且降低機體防御功能及修復能力?，F(xiàn)有證據(jù)表明[5，6]，白細胞介素17A（IL-17A）參與了肺損傷，但其對PM2.5 誘導的肺損傷作用機制仍然未知。在此，我們將明確IL-17A 在PM2.5 導致的肺損傷機制中可能產(chǎn)生的作用，并探討PM2.5 誘導的肺損傷小鼠模型中分泌IL-17A 的關鍵細胞類型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30 只C57BL/6J 雄性小鼠，6～7 周齡，體重20～30g，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

15 只IL-17A 基因敲除 （IL-17A-/-）C57BL/6J雄性小鼠6～8 周齡，體重25～35g，購買自賽業(yè)（廣州） 生物科技有限公司。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動物實驗中心（SPF 級）。本實驗經(jīng)中日友好醫(yī)院研究倫理委員會審核批準，實驗過程符合動物實驗研究管理規(guī)定。

1.2 造模與分組

將15 只野生型小鼠作為對照組，另外15 只野生型小鼠和15 只IL-17A-/-小鼠作為實驗組。將濃度為2mg/ml 的PM2.5 以氣管內(nèi)滴注方式進行造模，造模持續(xù)9d，每3d 進行一次氣管內(nèi)滴注，每只小鼠50μl。對照組和實驗組野生型、IL-17A-/-中各5 只小鼠分別在模型構(gòu)建的第3d、6d、9d 處死；然后將其肺組織和肺泡灌洗液進行病理染色、RT-qPCR、流式和ELISA。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS21.0 軟件進行統(tǒng)計分析，Graphpad Prism 5 軟件作圖；計量資料符合正態(tài)分布，表示為χ±s。組間比較采用方差分析進行兩兩比較；對于計量資料不符合正態(tài)性及方差齊性分布，組間比較采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5 可刺激小鼠肺組織中γδT 和Th17 細胞數(shù)量增加（圖1，見封三）

圖1 A.實驗組野生型小鼠和對照組小鼠肺組織的HE染色分析（×400）。B.肺泡灌洗液分析，左圖示總細胞數(shù)，右圖示中性粒細胞數(shù)，* 與對照組相比，P ＜0.05。C～F.流式細胞術分析在PM2.5造模后的第3d、6d、9d時IL-17A+細胞的數(shù)目。* 與第3d相比，P ＜0.05，# 與第6d相比，P ＜0.05。

在實驗組野生型小鼠中，肺組織經(jīng)HE 染色后顯示被大量炎性細胞浸潤（圖1A）。通過對肺泡灌洗液細胞統(tǒng)計分析提示：全細胞數(shù)量增加，中性粒細胞顯著增加（P＜0.05，圖1B）。在PM2.5 造模后的第3d、6d、9d，實驗組野生型小鼠肺組織中γδT 和Th17 細胞的含量逐漸增加，并具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖1D～1F），而對照組小鼠肺組織中γδT 和Th17 細胞的含量變化則沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05，圖1C、1E 和1F）。

2.2 PM2.5 可通過誘導小鼠肺組織中γδT 和Th17 細胞增加，刺激分泌IL-17A（圖2，見封三）

研究表明γδT 和Th17 細胞都可以分泌IL-17，Th17細胞在2005年被發(fā)現(xiàn)和命名，是在TGF-β 和IL-6 的共同誘導下由CD4+T 細胞分化而來，它最重要的效應因子就是IL-17A[7～9]。因此，我們使用RT-qPCR 方法在實驗組野生型模型建立的第3d、6d、9d 檢測實驗組小鼠Th17 的mRNA表達，發(fā)現(xiàn)Th17 的mRNA 表達水平呈上升趨勢（P＜0.05，圖2A）。通過ELISA 檢測對照組和實驗組野生型小鼠肺泡灌洗上清液中炎性因子IL-1β和TNF-α 的含量，結(jié)果表明與對照組相比，實驗組野生型小鼠在造模后第9d，IL-17A、IL-1β 和TNF-α 的含量顯著增加（P＜0.05，圖2B、2C）。同時，還應用RT-qPCR檢測了2 組小鼠TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達水平（P＜0.05，圖2D），這也證實了ELISA 的結(jié)果。通過對IL-17A-/-小鼠肺組織HE 染色研究表明，與造模第9d 的實驗組野生型小鼠相比，IL-17A-/-組小鼠肺組織中的炎性細胞浸潤顯著減少（圖2E）。與第9d 實驗組野生型小鼠相比，IL-17A-/-組小鼠肺泡灌洗上清液中IL-1β 和TNF-α 的含量顯著降低（P＜0.05，圖2F），全細胞數(shù)量及中性粒細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05，圖2G），并且TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達水平呈明顯降低趨勢（P＜0.05，圖2H）。

3 討論

近年來，流行病學數(shù)據(jù)[10]已經(jīng)表明，肺、心血管疾病以及癌癥的發(fā)病率和死亡率與我們?nèi)粘Ｉ钪車h(huán)境中PM2.5 的濃度有關，同時也帶來了較重的社會經(jīng)濟負擔。并且即使短期內(nèi)PM2.5 濃度的升高也可能導致死亡率和發(fā)病率的增加[11]。PM2.5 通過沉降和擴散過程沉積在肺實質(zhì)中，特別是肺泡中，也可以通過循環(huán)系統(tǒng)到達心、肝、脾、腦[12]，導致全身多器官受損。因此，本實驗研究旨在證明PM2.5 誘導肺部炎癥反應的細胞機制。

組織損傷的炎癥反應中，在巨噬細胞、樹突細胞等抗原提成細胞作用下，輔助性T 細胞（Th 細胞）被激活，開啟細胞免疫。眾所周知，Th 細胞表面標志物為CD4。初始CD4+T 細胞接受抗原刺激后，在不同的條件下可分化成不同亞型的T 細胞，執(zhí)行不同功能，如Th1 細胞、Th2 細胞。Th17細胞在21 世紀初被發(fā)現(xiàn)和命名，其與Th1 細胞、Th2 細胞不同，是在TGF-β 和IL-6 的共同誘導下由CD4+T 細胞分化而來。Th17 細胞主要分泌IL-17A（IL-17）、IL-17F、IL-21、IL-22，其中最重要的效應因子是IL-17A[7]。IL-17A 具有強大的致炎性，參與腫瘤、感染和自身免疫性疾病等多種炎癥性疾病，其受體IL-17R 表達多種細胞表面，如巨噬細胞、淋巴細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等。IL-17A 與受體（IL-17R）結(jié)合后，可通過MAPK、NF-κB、ERK 等通路[8，9]，刺激多種細胞分泌多種促炎因子，如IL-6、IL-8、GM-CSF，從而導致炎癥的放大。但是，最近的實驗結(jié)果表明，Th17細胞不是IL-17A 的唯一來源。IL-17A 也能夠由γδT 細胞、中性粒細胞和CD8 T 細胞分泌。

近年研究報道，IL-17A 參與肺臟損害，包括在哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病中[3，7，9，10]。Th17細胞來源的IL-17A 增加氣道高反應性、加重哮喘[13]。在博萊霉素誘導的肺纖維化模型中，IL-17A被認為是纖維化過程高度依賴的分子[14]。國內(nèi)學者在既往研究COPD 的肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)，肺組織中IL-17A 顯著升高，同時觀察到肺組織中γδT+細胞浸潤增加[15]。在腎臟纖維化研究中，敲除IL-17A 基因后，病灶處的淋巴細胞浸潤明顯減少，并且證明γδT+和Th17 細胞是IL-17A 共同的細胞來源，同時體外實驗證明IL-17A 劑量依賴性的促進單核-巨噬細胞遷移。

我們發(fā)現(xiàn)，PM2.5 促進γδT/ Th17 細胞中IL-17A 的分泌并加劇炎癥反應。而且已知IL-17A 在肺損傷過程中存在大量表達[15，16]。有證據(jù)表明，γδT 細胞和Th17 細胞均分泌IL-17A，從而加劇炎癥反應[16]。感染初期產(chǎn)生IL-17A 的最多是γδT細胞，這時Th17 細胞對IL-17A 主要起到一定保護性作用。Baldeviano 等[17]發(fā)現(xiàn)，IL-17A 能夠刺激擴張型心肌病的發(fā)展，若抑制IL-17A 可以減少由心肌炎引起的心肌纖維化。Smith 等[18]人的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-17A 可以降低ApoE2/2 小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生率，Wilson 等[19]人也證明了BLM介導的肺纖維化依賴于IL-17A。

綜上所述，這項動物實驗研究證明了PM2.5可以通過誘導小鼠γδT 和Th17 細胞分泌IL-17A，從而加劇肺部炎癥反應。對于PM2.5 誘發(fā)和加重的多種呼吸系統(tǒng)疾病，目前還缺乏有效的防治手段。但我們對IL-17A 導致的肺損傷作用有了新的認識，可針對PM2.5 誘發(fā)的肺部疾病尋求新的干預措施。有研究[20，21]發(fā)現(xiàn)固本止咳中藥可以減少肺組織中γδT 和炎癥細胞的浸潤，為我們下一步研究中醫(yī)藥干預PM2.5 導致的肺損傷指明了方向。筆者認為，深入而系統(tǒng)地研究空氣污染尤其是PM2.5 所致人體危害，特別是呼吸系統(tǒng)危害，具有重要的科學意義和臨床價值，對減輕社會經(jīng)濟負擔亦有積極作用。