楊 帆，楊 敏，徐春羽，龐思思，王曉梅，胡祖廣，張忠山

(1.湖州師范學院 生命科學學院，浙江 湖州 313000;2.寧波莫寧森家庭農(nóng)場有限公司，浙江 寧波 315734)

0 引 言

壇紫菜(Porphyrahaitanensis)隸屬紅藻門(Rhodophyta)紅毛菜科(Bangiacea)紫菜屬(Porphyra)，占我國紫菜總產(chǎn)量的50%以上[1].紫菜主要分5次采收，即頭水、二水、三水、四水和末水紫菜，其營養(yǎng)價值逐漸降低，粗纖維含量不斷上升[2].末水紫菜價格低，多數(shù)養(yǎng)殖戶都不予采收.但末水紫菜作為一種豐富的海洋資源，其生產(chǎn)效益有待進一步開發(fā).

壇紫菜含有大量的微量元素和無機鹽類，且鮮美可口，除食用外還可有效治療甲狀腺水腫和減少體內(nèi)膽甾醇，同時具有降血脂、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、抗輻射和抗癌的作用[3-8]，是一種重要的經(jīng)濟海藻.目前將紫菜發(fā)酵液作為類似植物生長激素方面的報道還不多見.本文以末水紫菜微生物發(fā)酵提取液為研究對象，探究不同樣品的抗氧化自由基活性，并通過種子發(fā)芽試驗來確定末水紫菜發(fā)酵液的生物調(diào)節(jié)作用，全面測定末水紫菜發(fā)酵液的各組成含量，進一步證明末水紫菜發(fā)酵液在抗氧化、植物生長調(diào)節(jié)[9]等方面的潛力，實現(xiàn)末水紫菜的高值化利用.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

末水紫菜(2019年10月采摘自溫州洞頭)、硝基四氮唑藍(NBT)(國藥集團生產(chǎn))、吩嗪硫酸鉀酯(PMS)(上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)).其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、UV-1100D，UV-1200型紫外/可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器公司)、全溫振蕩器(常州億通分析儀器制造有限公司)等.

1.2 方 法

1.2.1 酵母菌活化

稱取安琪干酵母4.0 g，加入60 mL無菌水，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)活化30 min，至表面出現(xiàn)大量氣泡即可使用.

1.2.2 末水紫菜發(fā)酵液的制備

末水紫菜發(fā)酵液生產(chǎn)流程見圖1.

圖1 末水紫菜發(fā)酵液生產(chǎn)流程Fig.1 Production process of dried laver fermentation broth

前處理：將末水紫菜置于恒溫箱中干燥，粉碎過篩制成干品.

浸泡：稱取干品1、干品2、干品3三份原料，分別按照料液比1∶10、1∶15、1∶20加入100 mL無菌水，機械混合均勻制成末水紫菜原液.

高溫滅菌：將上述末水紫菜原液置于121 ℃高溫中滅菌30 min.

接種：待處理好的末水紫菜源液冷卻至常溫后，在無菌操作臺上將活化的酵母菌接種至滅菌后的末水紫菜原液中，接種量為4%.

發(fā)酵：接種完成后置于30 ℃的全溫振蕩器中培養(yǎng)48 h.

離心：將發(fā)酵液離心并過濾得到上清液，即為末水紫菜發(fā)酵液，并分別標號為樣品1、樣品2、樣品3，冷藏，備用于各項指標的檢測.

1.2.3 末水紫菜發(fā)酵液抗氧化活性的測定

末水紫菜發(fā)酵液總抗氧化能力按照鉬酸銨體系方法檢測[10]，DPPH自由基清除能力按照文獻修改檢測[11]，超氧陰離子清除活性按照NADH-NBT方法檢測并稍作修改[12]，還原活性按照鐵氰化鉀-三氯化鐵方法測定并稍作修改[13].

1.2.4 末水紫菜發(fā)酵液的組成分析

總糖含量的測定采用苯酚硫酸法[14]；蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford法[15]；有機質(zhì)、總氮磷鉀、重金屬含量的測定分別參照標準NYT1976-2010《水溶肥料 有機質(zhì)含量的測定》、NYT1977-2010《水溶肥料 總氮磷鉀含量的測定》、NY 1110-2010《水溶肥料 汞、砷、鎘、鉛、鉻的限量要求》[16-18].

1.2.5 種子發(fā)芽實驗

篩選顆粒均勻、大小一致的黃瓜、小麥種子進行試驗.根據(jù)預試驗結(jié)果，種子滅菌后置于保溫箱內(nèi)用抗氧化活性與組成成分較優(yōu)的末水紫菜發(fā)酵液浸泡12 h；以培養(yǎng)皿為容器，在培養(yǎng)皿底部放無菌濾紙制成發(fā)芽床；取3個濃度的末水紫菜發(fā)酵液澆灌發(fā)芽床，以無菌蒸餾水澆灌作為對照，將種子均勻地排列在發(fā)芽床上[19]，每處理3次重復.

種子發(fā)芽率與自毒效應指數(shù)按如下公式計算：

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽終期正常發(fā)芽種子數(shù)/全部種子數(shù))×100%.

根據(jù)各處理發(fā)芽率(T)和對照發(fā)芽率(C)計算自毒作用指數(shù)(RI)：

RI=(T-C)/C.

當RI>0時，表示末水紫菜發(fā)酵液對種子發(fā)芽具有促進作用；當RI<0時，表示末水紫菜發(fā)酵液對種子發(fā)芽具有抑制作用.

2 結(jié)果與討論

2.1 末水紫菜發(fā)酵液的組成成分

3種料液比樣品均為液體，顏色呈棕色，樣品2的顏色較深且呈紅棕色.各樣品溶液都有一定的粘度.

半乳糖標準曲線的相關(guān)系數(shù)：R2=0.980 3，Y=6.735 7X-0.054 6.

蛋白質(zhì)標準曲線的相關(guān)系數(shù)：R2=0.998 8，Y=6.644 8X+0.001 6.

由表1可見：3種樣品的總糖含量較高，隨著料液比的不斷下降，總糖含量也不斷降低，樣品1的總糖量為1.5 g/L(最高值)，樣品3的總糖量為0.5 g/L(最低值)；3種樣品的蛋白質(zhì)含量差異較大，且總蛋白含量隨著料液比的下降不斷減少，樣品1的最大蛋白質(zhì)含量為1.2 g/L，是樣品3的11倍；3種樣品的有機質(zhì)含量差異較小，其含量隨著料液比的不斷下降而降低，樣品1的有機質(zhì)含量最大值為24.3 g/L，樣品3的有機質(zhì)含量最低，僅為15.5 g/L；3種樣品的磷(以P2O5計)含量較低，均低于0.3 g/L，鉀元素含量較高，這與末水紫菜內(nèi)含有大量的鉀元素相關(guān)，料液比對氮元素含量影響較低，基本可以忽略.

表1 不同樣品組成含量分析

2.2 重金屬元素含量

由表2可見，3種樣品的重金屬含量均處于標準值內(nèi)，汞、鎘含量與料液比成正比，且各重金屬含量均低于限量值，完全符合水溶肥料汞、砷、鎘、鉛、鉻的限量要求.

表2 不同樣品重金屬含量

從總體看，在末水紫菜發(fā)酵液的化學組成方面，其內(nèi)部組成與料液比存在線性關(guān)系，且料液比主要影響蛋白質(zhì)、總糖、有機質(zhì)和鉀元素的含量.樣品1的總糖含量高達1.5 g/L，是樣品2的1.3倍，是樣品3的2.7倍.樣品1在蛋白質(zhì)、有機質(zhì)和鉀含量上存在較大優(yōu)勢，尤其在鉀元素方面，樣品1的鉀含量遠高于其他兩種樣品.3種樣品的重金屬含量沒有較大差別.

2.3 末水紫菜發(fā)酵液的抗氧化活性

2.3.1 總抗氧化活性

各樣品的總抗氧化活性見圖2.由圖2可見：3種樣品的總抗氧化活性良好，且隨著濃度的增加而增大；樣品1和樣品2的抗氧化活性優(yōu)于樣品3；3種樣品的總抗氧化活性均在原液濃度為0.2 mg/mL時達到最高值.由此可知，末水紫菜發(fā)酵液的總抗氧化活性與濃度成正比.

圖2 末水紫菜發(fā)酵液的總抗氧化活性Fig.2 Total antioxidant activity of the fermented broth of dried laver

2.3.2 DPPH自由基清除活性

各樣品對DPPH自由基的清除活性見圖3.實驗結(jié)果顯示：3種樣品對DPPH自由基均有不同程度的清除作用，其清除能力與濃度成正比;在濃度為0～0.037 5 mg/mL時，樣品3對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢;在0.037 5～0.075 mg/mL時，樣品3對DPPH自由基的清除效果趨于平緩;在最大濃度為0.075mg/mL時，3種樣品對DPPH自由基的清除率分別為19.67%、81.38%和77.47%.

圖3 末水紫菜發(fā)酵液的DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of the fermented broth of dried laver

2.3.3 超氧陰離子清除活性

圖4 末水紫菜發(fā)酵液的超氧陰離子清除活性Fig.4 Superoxide anion scavenging activity of the fermented broth of dried laver

2.3.4 鐵離子還原活性

各樣品對鐵離子的還原活性見圖5.由圖5可見：3種樣品的末水紫菜發(fā)酵液對鐵離子均有不同程度的還原活性，其還原活性隨原液濃度的增大而增強，且樣品1的還原活性顯著高于其他兩種樣品；在最大濃度時，3種樣品達到的最大吸光度為1.285、0.717和0.684.

圖5 末水紫菜發(fā)酵液的鐵離子還原活性Fig.5 Iron ion reduction activity of the fermented broth of dried laver

從整體看，不同料液比的末水紫菜發(fā)酵液的抗氧化活性差異較大.樣品1的總抗氧化活性達2.4，是樣品2的1.2倍和樣品3的1.9倍.盡管樣品1的DPPH清除活性不太理想，但在超氧陰離子清除活性和鐵離子還原活性方面具有良好的抗氧化作用.

2.4 種子發(fā)芽實驗

2.4.1 末水紫菜發(fā)酵液對小麥種子發(fā)芽率的影響

根據(jù)上述實驗結(jié)果，本文選取樣品1進行小麥種子萌發(fā)實驗.如表3所示，樣品1加水稀釋200倍處理后的小麥種子發(fā)芽率最高，稀釋100倍、400倍處理后的小麥種子發(fā)芽率依次為97.14%、98.57%，其中稀釋200倍處理后的小麥種子自毒效應指數(shù)(RI)高于其它兩個稀釋液.

表3 末水紫菜發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)處理對小麥種子發(fā)芽率和RI的影響

2.4.2 末水紫菜發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽率的影響

如表4所示，樣品1稀釋200倍處理后的黃瓜種子發(fā)芽率最高，稀釋100倍、400倍處理的黃瓜種子發(fā)芽率依次為72%、80%，其中稀釋200倍處理后的黃瓜種子自毒效應指數(shù)(RI)高于其他兩個稀釋液.由此表明，末水紫菜發(fā)酵液對黃瓜種子發(fā)芽具有極大的促進作用.

表4 末水紫菜發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)處理對黃瓜種子發(fā)芽率和RI的影響

3 討 論

通過3個不同體系的實驗，測定3種末水紫菜發(fā)酵液的抗氧化活性，并對其組成成分及其對種子萌發(fā)的影響進行分析.結(jié)果顯示：在抗氧化能力方面，3種末水紫菜發(fā)酵液均具有抗氧化活性，最強抗氧化樣品1的液料比為1∶10，盡管其對DPPH清除活性不太理想，但在超氧陰離子清除活性和鐵離子還原活性方面具有良好的抗氧化作用；在組成含量分析方面，總糖、蛋白質(zhì)、有機質(zhì)含量均與料液比呈線性關(guān)系，特別在蛋白質(zhì)方面，樣品1的蛋白質(zhì)含量最大值為1.2 mg/mL，是樣品3的11倍，且在鉀含量方面，樣品1占有絕對優(yōu)勢；選取較優(yōu)的抗氧化組分和組分含量較高的樣品1進行種子萌發(fā)實驗的結(jié)果表明，加入發(fā)酵液處理的種子發(fā)芽率均比空白對照組高，且原液稀釋200倍處理的小麥種子發(fā)芽率達100%，較空白對照組增長4.3%，黃瓜種子發(fā)芽率達84%，較空白對照組增長14%.由此可見，末水紫菜發(fā)酵液較優(yōu)的發(fā)酵工藝可以解決因其利用率不高而隨意丟棄導致的生態(tài)污染問題.對紫菜發(fā)酵液的深度研究能更好地促進抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)，制備符合國家標準的天然綠色有機肥.