李成森，劉天竹，張 曄，郭漢文，施 法

（1.遼寧省檢驗檢測認證中心遼寧省藥品檢驗檢測院，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧省沈陽市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽 110044；3.遼寧省沈陽市食品藥品檢驗所，遼寧 沈陽 110136）

五海癭瘤丸功效為軟堅消腫，用于痰核癭瘤、瘰疬、乳核，臨床廣泛用于治療腫瘤［1］，由海帶、海藻、海螵蛸、蛤殼、昆布、海螺（煅）等多種海洋類來源中藥材組方，而海藻、昆布、海螵蛸均為《中國藥典》收載品種［2］。海洋來源中藥材的重金屬及有害元素殘留風(fēng)險較高，2020年版《中國藥典（四部）》中規(guī)定：“海藻、昆布、海螵蛸的重金屬及有害元素限度為Pb＜5 mg/kg，Cd＜5 mg/kg，As＜10 mg/kg，Hg＜0.2 mg/kg，Cu＜20 mg/kg?！保?］本研究中采用微波消解和人工胃液仿生提取法進行前處理，并以電感耦合等離子體－質(zhì)譜（ICP－MS）法測定五海癭瘤丸中鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、銅（Cu）、鋁（Al）、鈷（Co）、釩（V）、硒（Se）、鉬（Mo）、鉻（Cr）、鎳（Ni）、鐵（Fe）、銻（Sb）、錫（Sn）、鋰（Li）、鋇（Ba）17種重金屬及有害元素的殘留量，并對仿生提取能溶出的元素進行健康風(fēng)險評估，為臨床用藥的安全性提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7700型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；Mars微波消解儀（美國CEM公司）；Milli－Q型超純水儀（美國Millipore公司）；CP225D型分析天平（精度為十萬分之一），BSA224S－CW分析天平（精度為萬分之一），均購自德國賽多利斯公司。

1.2 試藥

ICP分析用多元素標準溶液（批號為GSM－M231901－2013，質(zhì)量濃度為100μg/mL），Hg標準溶液（批號為GSB 04－1750－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），Ge標準溶液（批號為GSB 04－1728－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），銦（In）標準溶液（批號為GSB 04－1731－2004，質(zhì) 量濃度 為1 000μg/mL），鉍（Bi）標準 溶液（批號為GSB04－1719－2004，質(zhì)量濃度為1000μg/mL），鈧（Sc）標準溶液（GSB 04－1750－2004，質(zhì)量濃度為1 000μg/mL），均購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；ICP－MS貯備調(diào)諧溶液（含Co，Li，Ti，V，美國安捷倫公司，質(zhì)量濃度為10μg/mL）；硝酸（優(yōu)級純，F(xiàn)isher公司）；鹽酸、胃蛋白酶均為優(yōu)級純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；柑橘葉（地球物理地球化學(xué)勘察研究所，批號為GBW 10020＜GSB－11＞）；五海癭瘤丸（企業(yè)A，共15批）。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器參數(shù)

射頻功率：1.5 kW；等離子體氣流量：15 L/min；載氣流量：0.8 L/min；碰撞氣流量：0.4 L/min；氦氣流量：4～5 mL/min；霧化室溫度：2℃；樣品提升速率：0.3 r/s；采樣深度：8 mm。

2.2 溶液制備

標準溶液1：精密量取ICP分析用多元素標準溶液適量，用2%硝酸稀釋成質(zhì)量濃度分別為1，2，5，10，20，50，100μg/L的系列標準溶液1。

標準溶液2：精密量取Hg單元素標準溶液適量，用2%硝酸稀釋成質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8，2.0，4.0，10.0，20.0μg/L的系列標準溶液2。

內(nèi)標溶液：精密量取Ge，In，Bi，Sc標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成質(zhì)量濃度為20μg/L的混合內(nèi)標溶液。

供試品溶液Ⅰ（總元素量）：取樣品0.3 g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，精密加入硝酸10 mL，置微波消解儀內(nèi)，按表1程序消解。消解完成后，打開消解罐，置趕酸器上120℃趕酸，待趕至3～5 mL時倒出消解液，用少量水洗滌消解罐3次，合并洗液，置50 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液Ⅰ。同法制備空白樣品Ⅰ。

表1 微波消解程序Tab.1 Digestion procedure of microwave

供試品溶液Ⅱ（仿生提取液）：取樣品0.3 g，精密稱定，精密加入人工胃液（取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻，加水稀釋成1 000 mL，即得）30 mL，置37℃恒溫超聲提取2 h，4 000 r/min離心10 min，精密量取上清液25 mL，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，用趕酸器低溫濃縮至3 mL，冷卻，加入硝酸10mL，蓋上罐蓋后置微波消解儀中，同供試品溶液Ⅰ的制備方法制備供試品溶液Ⅱ。同法制備空白樣品Ⅱ。

2.3 測定方法

按同位素豐度表推薦的質(zhì)量數(shù)選取同位素，分別為208Pb，111Cd，75As，63Cu，27Al，51V，52Cr，56Fe，59Co，60Ni，96Mo，79Se，118Sn，121Sb，7Li，137Ba，202Hg。其中7Li，27Al，51V，52Cr，56Fe以45Sc作內(nèi)標；59Co，60Ni，63Cu，96Mo，79Se，75As以72Ge作 內(nèi) 標；111Cd，118Sn以115In作內(nèi) 標；121Sb，137Ba，202Hg，208Pb以209Bi作內(nèi)標。按2.2項下方法制備供試品溶液，以各元素的響應(yīng)值與內(nèi)標響應(yīng)值的比值（Y）為縱坐標、質(zhì)量濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)不低于0.995。

2.4 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、檢測限及定量限確定：取系列標準溶液，按擬訂條件測定，以各元素質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、響應(yīng)值（Y）為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果見表2。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為20200303）適量，依法平行制備6份供試品溶液，進樣測定，計算各元素的含量及RSD。結(jié)果見表2，表明方法重復(fù)性良好。

中間精密度試驗：取樣品（批號為20200303）適量，在不同時間由不同人員按擬訂方法分別平行測定6次，計算各元素測定值的RSD。結(jié)果見表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：按2.2項下方法制備供試品溶液，于室溫放置0，2，4，8，24，48 h時進樣測定，并用新鮮配制的標準溶液繪制標準曲線，計算測定結(jié)果的RSD。結(jié)果見表2，表明供試品溶液在室溫下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取樣品1.5 g，精密稱定，置微波消解罐中，分別精密量取標準溶液1、標準溶液2各適量，加入微波消解罐中，加標濃度分別為系列標準溶液的第2，3，4點3個濃度，按2.2項下方法制備供試品溶液，并進樣測定，計算加樣回收率及RSD。結(jié)果見表2。

表2 17種重金屬及有害元素方法學(xué)考察結(jié)果Tab.2 Results of methodological investigations of 17 heavy metals and harmful elements

準確度試驗：以柑橘葉標準物質(zhì)為參考，結(jié)果見表3。結(jié)果基本相符，表明方法準確可靠。

表3 標準物質(zhì)（柑橘葉）測定結(jié)果Tab.3 Determination results of standard materials（Citri Reticulatae Folium）

2.5 樣品含量測定

總元素量測定結(jié)果：取15批樣品，按2.2項下方法制備供試液，按擬訂條件進樣測定，計算樣品中各元素的含量。結(jié)果見表4。

表4 15批五海癭瘤丸中17種重金屬及有害元素的總元素含量測定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.4 Determination results of total content of 17 heavy metals and harmful elements in 15 batches of Wuhaiyingliu Pills（μg/g，n＝3）

仿生提取樣品元素測定：取15批樣品，按仿生提取供試品溶液制備方法制備供試液，按擬訂條件進樣測定，計算樣品中各元素的含量。結(jié)果Cd，Hg，Al，Se，Mo，F(xiàn)e，Sb，Sn，Ba等元素均無溶出或未檢出，其他元素均有溶出。詳見表5。

表5 15批五海癭瘤丸中17種重金屬及有害元素仿生提取測定結(jié)果（μg/g，n＝3）Tab.5 Determination results of 17 heavy metals and harmful elements extracted by biomimetic extraction method from 15 batches of Wuhaiyingliu Pills（μg/g，n＝3）

2.6 五海癭瘤丸重金屬風(fēng)險評估

風(fēng)險評估Ⅰ：對于仿生提取檢出的元素，需要對其進行風(fēng)險評估。參考國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）Q3D的方法［4］，PDE為每日允許暴露量，五海癭瘤丸的日最大服用劑量為18 g，按公式1）計算日最大允許暴露量，結(jié)果見表6。

日最大允許暴露量＝PDE/日服最大服用劑量1）

風(fēng)險評估Ⅱ：參照《中藥中外源性有害殘留物安全風(fēng)險評估技術(shù)指導(dǎo)原則》［5］及文獻［6－9］，對于五海癭瘤丸中8種仿生溶出重金屬及有害元素的暴露評估，按公式2）計算日攝入量（Exp），再按公式3）計算元素危害指數(shù)（HI）。HI值可反映中藥中重金屬及有害元素的健康風(fēng)險。HI＜1表示中藥中重金屬及有害元素的健康風(fēng)險較低；HI＞1表示健康風(fēng)險較高，應(yīng)予以關(guān)注。

其中，A為日允許攝入量（μg/kg）；W為人體平均體質(zhì)量（一般按63 kg計）；IR為日最大劑量（18 g）；AT為平均壽命天數(shù)（365天/年×70年）；EF為中藥服用頻率（90天/年）；ED為一生的暴露年限（20年）；10為安全因子，表示每日由中藥材及其制品中攝取的重金屬量不大于日總暴露量的10%。C為樣品中元素平均濃度（mg/kg）。結(jié)果見表6。可見，8種 元 素HI值 為0～0.168，表明五海癭瘤丸中仿生提取出的8種元素的健康風(fēng)險較低。

表6 仿生溶出元素每日最大允許暴露量和最大限量理論值Tab.6 Maximum allowable daily exposure and maximum theoreticalvalue of biomimetic dissolved elements

3 討論

海洋來源藥材本身受海洋環(huán)境的影響，相較于陸生動植物來源藥材，其重金屬及有害元素含量較高，限度值也較高，故需嚴格監(jiān)測其用藥安全性［10－15］。ICH指導(dǎo)原則Q3D元素雜質(zhì)指導(dǎo)原則中1類元素As，Cd，Hg，Pb是對人體有毒性的物質(zhì)，已限制或不再用于藥品生產(chǎn)，需在風(fēng)險評估中進行評價；2A類的元素為在藥品中出現(xiàn)可能性相對較高的元素，需對所有攝入途徑進行風(fēng)險評估，如Co，Ni，V；2B類和3類是自然含量較低且在藥品中出現(xiàn)的可能性較小的元素，如Cu，Ni，Sb，Sn，Se，Li等。Al，Cr，F(xiàn)e，Ba等金屬元素易在生產(chǎn)加工過程中引入［16－17］。故選定Pb，Cd，As，Hg，Cu，Al，Co，V，Se，Mo，Cr，Ni，F(xiàn)e，Sb，Sn，Li，Ba 17種元素作為研究對象。

本試驗中考察了人工胃液和人工腸液分別進行提取的方式，結(jié)果樣品在人工胃液中的溶出率遠高于人工腸液?？紤]到胃液為弱酸性，腸液為中性，藥物的體內(nèi)吸收過程也是先經(jīng)過胃液的提取后再接觸腸液。因此，采用人工胃液進行仿生提取能確保仿生提取試驗的合理性和準確性［18］。

15批樣品中，As的總量均值為36 mg/kg，超過日最大允許暴露量，提示有安全隱患。仿生提取后溶出As的平均含量為2.4 mg/kg，HI為0.168。表明用藥健康風(fēng)險較小。

綜上所述，五海癭瘤丸總體無重大重金屬及有害元素殘留風(fēng)險，在質(zhì)量穩(wěn)定的情況下，其用藥安全可得到保障。中成藥從原料藥到成品均應(yīng)嚴格控制質(zhì)量，建議盡快建立統(tǒng)一的適應(yīng)中成藥特點的風(fēng)險評估模式和質(zhì)量控制方法。