傅 瀟,田 濤,向蘿成玲,劉夢潔,姜麗麗,王文娟,梁 璇,阮之平,姚 煜

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:136690205@qq.com)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一,最新數據顯示,肝癌死亡率占惡性腫瘤死亡率的第4位[1]。在我國,每年約有42萬人死于肝癌,位居惡性腫瘤第2位[2]。原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝癌最主要的病理類型,具有起病隱匿,預后差,病情發(fā)展迅速、臨床效果不佳等特點。雖然免疫檢查點抑制劑,即PD-1/PD-L1單抗的出現為晚期肝癌治療提供了新的思路和選擇,但是有限的療效只能使部分患者獲益[3,4]。因此,明確肝癌腫瘤微環(huán)境的調控機制,是提高肝癌免疫治療應答的關鍵。

PTEN全稱為磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog),于1997年被發(fā)現[5],PTEN通過其脂質磷酸酶活性拮抗磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶B(PKB,又稱Akt)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)途徑,控制細胞的多種生物學過程,包括存活、增殖和能量代謝等[6,7]。我們的前期研究發(fā)現,低表達PTEN不僅促進肝癌發(fā)生發(fā)展[8,9],而且通過促進血管生成[10]和上皮間質化生[11],調控肝癌腫瘤微環(huán)境形成。既往研究發(fā)現,PTEN表達缺失導致殺傷性T細胞數量減少和殺傷能力下降[12];通過異常激活PI3K/Akt通路引起PD-L1表達升高[13],從而引起腫瘤免疫耐受。但是,在肝癌中,PTEN與免疫微環(huán)境形成的關系尚未明確。在本研究中,我們擬通過構建小鼠皮下移植瘤模型,利用PTEN siRNA降低PTEN表達,以探索PTEN在肝癌腫瘤免疫微環(huán)境形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HePa1-6細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。DMEM培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素溶液和胎牛血清購自美國Hyclone生物公司,胰蛋白酶和乙二胺四乙酸購自上海亨代勞商貿有限公司,總RNA極速抽提試劑盒Fast200TM購自北京天根生物有限公司,TAKARA PrimeScriptTMRT Master Mix和SYRB?Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本Takara公司,PTEN、CD8、Foxp3、PD-L1、ICOS和IDO抗體及免疫組化試劑盒均購自北京博奧森生物有限公司。CD4和CD25抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 小鼠皮下移植瘤構建

實驗小鼠C57BL/6用于構建小鼠同種皮下移植瘤模型。選取生長良好的HePa1-6細胞持續(xù)培養(yǎng)48 h,常規(guī)胰酶/EDTA消化制成單細胞懸液,將Matrigel和無血清DMEM培養(yǎng)基按照1 ∶1比例重懸,調整細胞密度為1×108/ml;將10只4周齡C57BL/6小鼠常規(guī)消毒后,在其背側皮下注射100 μl細胞懸液;觀察移植瘤生長情況,用游標卡尺測量腫瘤結節(jié)的長徑(L)和短徑(W),按公式(L×W2/2)計算出腫瘤近似體積;細胞懸液注射后約1周,待腫瘤體積約為150 mm3(皮下可觸及)時,隨機將小鼠分為siRNA NC和PTEN siRNA組,分別皮下注射siRNA NC和PTEN siRNA;每周注射2次,干預3周后處死小鼠,獲得組織標本。

1.3 免疫組織化學法檢測移植瘤組織中CD8、Foxp3、PD-L1、IDO和ICOS的表達

切片二甲苯脫蠟,梯度酒精和純水水化;切片置于抗原修復液中,微波爐進行抗原修復;標本置于3%H2O2中室溫孵育,后用山羊血清封閉,封閉后洗滌封閉液;滴加稀釋的CD8、Foxp3、PD-L1、IDO或ICOS的一抗工作液,室溫孵育后置于濕盒內4 ℃過夜;洗滌一抗,滴加相應的生物標記二抗并于室溫孵育30 min,之后洗滌二抗;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素,室溫孵育后洗滌;二氨基聯本胺和H2O2孵育,自來水充分沖洗終止顯色反應;蘇木素復染;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.4 免疫熒光檢測移植瘤組織中CD4和CD25的表達

切片脫蠟、水化、抗原修復和封閉步驟同免疫組化。封閉后洗滌封閉液,滴加稀釋的CD4、CD25的一抗工作液;室溫孵育后置于濕盒內4 ℃過夜;洗滌一抗,滴加相應的熒光二抗并于室溫避光孵育60 min;沖掉二抗,放在切片架上,PBS洗滌;滴加DAPI至完全覆蓋組織以復染核8 min,PBS洗滌;擦干組織周圍液體,膠頭滴管滴加半滴抗熒光淬滅劑,蓋玻片封片。

1.5 RNA提取、逆轉錄和real-time qPCR檢測PTEN mRNA表達

組織RNA提取:稱取移植瘤組織質量并記錄,將移植瘤組織剪切成小塊后放入預冷的平皿中的鋼網上,加入生理鹽水(約1 ml/30 mg組織),用研磨棒將組織研磨擠壓過鋼網,收集過網懸液,取100 μl過濾液加入Eppendorf管,按照Fast200TM試劑盒說明書提取RNA,將提取的RNA置于-80 ℃保存。

逆轉錄和real-time qPCR:分別根據TAKARA PrimeScriptTMRT Master Mix和SYRB?Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行,利用real-time qPCR擴增儀進行熒光擴增,GAPDH作為管家基因,轉入siRNA NC組作為對照,采用2-ΔΔCt法分析PTEN的相對表達量(引物序列見表1)。

表1 PTEN siRNA和siRNA NC序列、PTEN和GAPDH引物序列

1.6 TCGA數據庫中Foxp3、PD-L1、IDO、ICOS、IFNAR1和IFNAR2的表達

TCGA數據通過FIREHOSE Broad GDAC(http://gdac.broadinstitute.org/)獲取。分析TCGA數據庫中365例肝癌患者PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境相關分子表達的相關性。根據PTEN表達的中位數,將365名肝癌患者分為PTEN高表達和低表達組。利用level 3 Illumina RNA-Seq and miRNA-Seq數據,經驗證數據服從正態(tài)分布且兩組總體方差相等后,應用Student-t檢驗分析PTEN高表達組和低表達組中Foxp3、PD-L1、IDO、ICOS、IFNAR1和IFNAR2的表達。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用IBM SPSS 23.0進行數據統(tǒng)計學分析。數據均以均數±標準誤表示。經驗證數據服從正態(tài)分布且兩組總體方差相等后，應用studentt檢驗比較兩組間差異。以雙側P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 下調PTEN促進移植瘤生長

通過qPCR和IHC均發(fā)現,與siRNA NC組相比,PTEN siRNA組移植瘤中PTEN在mRNA和蛋白層面的表達均較siRNA NC組顯著降低(P<0.05,見圖1)。PTEN siRNA組的移植瘤生長速率顯著高于siRNA NC組(P<0.05,見圖2)。提示PTEN siRNA下調移植瘤中PTEN的表達,并促進移植瘤增殖。

與siRNA NC組比較，**P<0.01圖1 PTEN siRNA下調PTEN表達Figure 1 PTEN siRNA reduces PTEN expression

與siRNA NC比較,*P<0.05圖2 下調PTEN促進移植瘤生長Figure 2 Down-regulation of PTEN expression promotes subcutaneous tumor growth

2.2 下調PTEN促進肝癌移植瘤的抑制性腫瘤免疫微環(huán)境形成

結果顯示:與siRNA NC組相比,PTEN siRNA組的移植瘤中CD8+T淋巴細胞浸潤顯著減少(P=0.008),而Foxp3+和CD4+CD25+T淋巴細胞顯著增多(P<0.05,見圖3)。同時,我們還發(fā)現:PTEN siRNA組的移植瘤中PD-L1、ICOS和IDO的表達顯著升高(P<0.05,見圖4)。說明下調PTEN后,小鼠移植瘤中免疫微環(huán)境呈抑制狀態(tài)。

與siRNA NC比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 注入PTEN siRNA和siRNA NC后IHC檢測小鼠移植瘤中CD8+T細胞、Foxp3+T細胞的分布,IF檢測CD4+CD25+T細胞的分布Figure 3 The distribution of CD8+T cells, Foxp3+T cells by IHC, and CD4+CD25+T cells by IF in subcutaneous tumors injected with PTEN siRNA and siRNA NC

與siRNA NC比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 注入PTEN siRNA和siRNA NC后應用IHC檢測小鼠移植瘤中PD-L1、ICOS和IDO的表達Figure 4 The expression of PD-L1, ICOS and IDO in subcutaneous tumors injected with PTEN siRNA and siRNA NC by IHC

2.3 PTEN與PD-L1、IDO、Foxp3、IFNAR1和IFNAR2在TCGA肝癌數據庫中表達相關性

TCGA數據結果發(fā)現:在PTEN高表達患者中PD-L1、Foxp3、ICOS和IDO的表達水平均低于低表達患者;而IFNAR1和IFNAR2在PTEN高表達患者中的表達顯著高于低表達患者(P<0.05,見表2)。

表2 PD-L1、Foxp3、ICOS、IDO、IFNAR1和IFNAR2在PTEN高表達和低表達患者中的表達

3 討論

本課題組的既往研究提示PTEN通過增強肝癌細胞增殖、侵襲、遷移和血管生成能力,促進肝癌發(fā)生發(fā)展和肝癌耐藥的發(fā)生[8-11],而PTEN和肝癌免疫微環(huán)境的研究仍十分有限?；诒菊n題組前期研究發(fā)現低表達的PTEN能夠促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質化生,促進肝癌細胞外泌體分泌[11],影響腫瘤微環(huán)境,本研究以期進一步明確PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境的相關性。

腫瘤浸潤性CD8+T淋巴細胞是腫瘤免疫中負責殺傷腫瘤的關鍵淋巴細胞,其浸潤程度提示了腫瘤對免疫檢查點抑制劑的應答效應。而Foxp3+T細胞,又稱為調節(jié)性T細胞(Treg)則調控了免疫平衡。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,與CD8+T淋巴細胞的殺傷腫瘤作用相反,Foxp3+T細胞則參與了免疫逃逸,并促進抑制性免疫微環(huán)境形成,引起腫瘤發(fā)生發(fā)展。在轉移性前列腺癌中,低豐度的CD8+T細胞與骨轉移相關,而Foxp3+T細胞的聚集則與肝轉移相關[14];在接受新輔助化療的乳腺癌患者中,高CD8/Foxp3比值提示較好的預后[15]。

Huynh等[16]的研究證實,PTEN/PI3K/Akt信號通路參與了Treg細胞穩(wěn)態(tài)和譜系穩(wěn)定性的調控。在腫瘤免疫中,PTEN也被證實與Foxp3+T細胞浸潤相關,并提示預后:低表達的PTEN和腫瘤中富集的CD4+Foxp3+T細胞浸潤被證實與子宮內膜癌不良預后相關[17]。不僅如此,在骨肉瘤中,低表達的PTEN不僅通過增加腫瘤Foxp3+T細胞的浸潤,而且還通過上調PD-L1表達,誘導骨肉瘤抑制性免疫微環(huán)境形成[18]。

基于此,本課題在構建的小鼠移植瘤模型中檢測了CD8+T細胞、Foxp3+和CD4+CD25+T細胞的分布和PD-L1表達,并發(fā)現下調PTEN引起腫瘤浸潤性CD8+T細胞減少,而Foxp3+和CD4+CD25+T細胞增多,且PD-L1表達上調。除外腫瘤浸潤性T細胞和PD-L1的表達,越來越多的腫瘤免疫標志物受到關注。與PD-L1相似,IDO和ICOS也在腫瘤免疫微環(huán)境形成中起到了抑制作用。本課題在下調PTEN的移植瘤中發(fā)現IDO和ICOS表達高,提示下調PTEN引起抑制性腫瘤免疫微環(huán)境的發(fā)生。

IFNAR1和IFNAR2是I型干擾素受體。干擾素只有與其受體結合后才能發(fā)揮腫瘤殺傷效應,IFNAR1和IFNAR2的表達與T細胞浸潤正相關[19],提示了腫瘤免疫激活程度。為了進一步明確PTEN與腫瘤免疫微環(huán)境的相關性,本課題在TCGA肝癌數據庫中分析結果提示,IFNAR1和IFNAR2在PTEN低表達的患者中顯著低于PTEN高表達的患者,提示低表達PTEN削弱了殺傷性T細胞的功能。

綜上所述,本課題通過本研究在動物體內和公共數據庫證實了低表達PTEN誘導了肝癌抑制性免疫微環(huán)境的形成。因此,恢復PTEN表達不僅可以抑制肝癌發(fā)生,還能夠逆轉腫瘤免疫逃逸。