蘇 瑞,梅春麗,李玉萍,李 銘,李 婷,趙 欣,盧家美,鄒曉榮*

(1中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院腎臟病科,西安 710054;2中國人民解放軍空軍第九八六醫(yī)院內(nèi)分泌科;3陜西省人民醫(yī)院特診科;4西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:Zouxiaorong986@163.com)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)患者的一種有效的腎臟替代療法。然而,長期暴露于各種不利因素(如生物不相容的腹膜透析溶液、尿毒癥、腹膜炎和基礎(chǔ)慢性腎臟疾病),會(huì)導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)的改變。這些變化包括間皮細(xì)胞的丟失、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生、血管生成的誘導(dǎo)等,從而引起腹膜纖維化和超濾功能下降,最終導(dǎo)致腹膜透析失敗。因此,尋求有效的防治腹膜纖維化的策略是非常重要的[1]。

EMT是上皮細(xì)胞失去其特有的上皮特性而獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的過程。許多生長因子和細(xì)胞因子參與了這一過程。其中,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)已被證實(shí)在腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展中起主導(dǎo)作用[2-5]。TGF-β1通過激活Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)腹膜纖維化[6]。此外,表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的激活也參與了這些過程[6]。STAT3是重要的轉(zhuǎn)錄因子,STAT3被激活后參與腹膜纖維化過程[7]。

纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑,并且是尿激酶型纖溶酶原激活物和組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator,tPA)的主要抑制劑[8-12],此外還進(jìn)一步抑制下游基質(zhì)金屬蛋白酶活化[13-15]。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn),PAI-1參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成,牛蒡子苷元減輕腹膜透析中的纖維化的機(jī)制與抑制PAI-1的表達(dá)有關(guān)[16]。

目前,PAI-1在腹膜纖維化中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示PAI-1在腹膜透析患者中的表達(dá)模式及其功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體質(zhì)量為20-25g左右的C57/BL6小鼠由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(陜)2020-005]。抗PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、EGFR、p-EGFR、Acetyl α-tubulin和β-actin的抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗和生物素標(biāo)記的二抗購自美國Cell Signaling Technologies公司?？笴ollagen Ⅰ、E-cadherin和α-SMA抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)購自美國ATCC。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Sigma-Aldrich公司。Opti-MEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。TGF-β1購自派普泰克生物科技(蘇州)有限公司。靶向PAI-1的小干擾RNA(si-PAI-1)及陰性對照siRNA(si-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。RIPA裂解液和蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。蘇木精伊紅(HE)染色和Masson三色染色試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 研究對象

納入2016年7月至2018年7月我院腹透中心長期規(guī)律隨訪的30例腹透患者(腹膜透析組)?；颊吣挲g大于18歲且透析齡滿2年;排除患有腫瘤、感染性疾病、結(jié)締組織疾病、心腦血管等臟器衰竭者。收集記錄所有納入患者性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、透析齡。另外,納入基線數(shù)據(jù)匹配的30例終末期腎病患者(終末期腎病組)。終末期腎病組患者是擬行腹膜透析管置管術(shù)者。均在手術(shù)中采集腹膜標(biāo)本,大小約18 mm×3 mm,選取前腹壁新切開的壁層腹膜。本研究通過空軍軍醫(yī)大學(xué)第986醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有入選患者均知情同意。

1.3 HPMCs細(xì)胞的處理和分組

人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃。然后細(xì)胞做如下分組處理:①為了驗(yàn)證TGF-β1對HPMCs中PAI-1蛋白表達(dá)的影響,將細(xì)胞分為正常對照組和TGF-β1組。正常對照組細(xì)胞正常培養(yǎng),TGF-β1組細(xì)胞用10 ng/ml TGF-β1培養(yǎng)24 h,通過Western blot檢測HPMCs中PAI-1的蛋白表達(dá)。②為了下調(diào)PAI-1的表達(dá),將細(xì)胞分為正常對照組、si-NC組和si-PAI-1組。正常對照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,si-NC組和si-PAI-1組細(xì)胞分別用si-NC和si-PAI-1轉(zhuǎn)染,通過Western blot檢測HPMCs中PAI-1的蛋白表達(dá)。③為了考察PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCs中EMT、TGF-β1/Smad3信號(hào)通路和EGFR/STAT3信號(hào)通路的影響,將細(xì)胞分為3組:正常對照組、TGF-β1+si-NC組和TGF-β1+si-PAI-1組。正常對照組細(xì)胞正常培養(yǎng),TGF-β1+si-NC組和TGF-β1+si-PAI-1組細(xì)胞分別用si-PAI-1及si-NC轉(zhuǎn)染后,在0.5% FBS DMEM饑餓HPMCs 24 h,然后將其在10 ng/ml TGF-β1中培養(yǎng)24 h。通過Western blot檢測腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、Collagen Ⅰ、E-cadherin、α-SMA、EGFR、p-EGFR和Acetyl α-tubulin的蛋白表達(dá)。

1.4 HPMCs的si-PAI-1及si-NC轉(zhuǎn)染

將HPMCs接種于不含抗生素的30%-40%融合培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,然后用lipofectamine 2000將si-PAI-1及si-NC(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染HPMCs。轉(zhuǎn)染24 h后,再用TGF-β1(10 ng/ml)處理24 h,然后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 腹膜纖維化小鼠模型的建立及動(dòng)物分組處理

小鼠每天腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液,連續(xù)注射28 d,建立腹膜纖維化模型[17]。將小鼠隨機(jī)分為3組,每組12只:正常對照組、腹膜纖維化+si-NC組(PF+si-NC組)和腹膜纖維化+si-PAI-1組(PF+si-PAI-1組)。正常對照組小鼠腹腔注射3 ml生理鹽水及300 μl Opti-MEM;PF+si-PAI-1組小鼠腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液及si-NC(0.1 mg/kg,溶于300 μl Opti-MEM);PF+si-PAI-1組小鼠腹腔注射3 ml含4.25%葡萄糖的腹膜透析液及si-PAI-1(0.1 mg/kg,溶于300 μl Opti-MEM)。28 d后處死所有小鼠,取壁層腹膜作進(jìn)一步分析。

1.6 Western blot檢測蛋白的表達(dá)

將腹膜組織用勻漿器勻漿,然后在RIPA裂解液中裂解,并在15 000 r/min離心15 min,取上清。用蛋白提取試劑盒提取蛋白。用BCA測定試劑盒測蛋白質(zhì)濃度。取150 μg蛋白煮沸變性,在12% SDS-PAGE凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%的牛血清白蛋白中封閉1 h后,將PVDF膜與PAI-1、p-STAT3、STAT3、p-Smad3、Smad3、Collagen Ⅰ、E-cadherin、α-SMA、EGFR、p-EGFR、Acetyl α-tubulin和β-actin一抗(1 ∶2 000)在4 ℃孵育過夜。然后,將PVDF膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在37 ℃下孵育1 h。使用ECL檢測試劑顯影,并使用Image J軟件計(jì)算條帶強(qiáng)度,β-actin作為內(nèi)參。

1.7 小鼠腹膜組織的HE染色和Masson三色染色

將小鼠腹膜組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋后切成4 μm厚切片。根據(jù)說明書對組織進(jìn)行HE染色和Masson三色染色。然后置于顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)為×200)。

1.8 免疫組織化學(xué)染色檢測患者和小鼠的腹膜切片中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA的表達(dá)

將患者和小鼠的腹膜切片脫蠟和水化后,用3% H2O2浸泡15 min,微波爐中加熱10 min。切片用山羊血清在37 ℃封閉30 min。將切片與一抗PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA(1 ∶500稀釋)在4 ℃過夜孵育。然后與生物素標(biāo)記的二抗在37 ℃孵育30 min,再與過氧化物酶試劑37 ℃孵育30 min,然后DAB在37 ℃孵育5 min。蘇木素復(fù)染核5 min。常規(guī)脫水、透明、封片后,用ImageJ軟件計(jì)算陽性細(xì)胞率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹膜透析患者和終末期腎病患者腹膜組織中PAI-1的表達(dá)

免疫組化染色顯示,與終末期腎病組比較,腹膜透析組腹膜組織中的PAI-1陽性率顯著升高(P<0.05,見圖1)。Western blot顯示,與終末期腎病組比較,腹膜透析組腹膜組織中的PAI-1蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖1)。

圖1 腹膜透析患者和終末期腎病患者腹膜組織中PAI-1的表達(dá)Figure 1 PAI-1 expression in peritoneal tissues of peritoneal dialysis patients and end-stage renal disease patients

2.2 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞EMT的影響

與正常對照組比較,TGF-β1組的腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05,見圖2)。轉(zhuǎn)染si-PAI-1下調(diào)了腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1的蛋白表達(dá)(P<0.05,見圖3)。

與正常對照組比較,TGF-β1+si-NC組腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白相對表達(dá)量顯著升高,E-cadherin顯著降低(P<0.05,見圖4)。與TGF-β1+si-NC組比較,TGF-β1+si-PAI-1組腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1、Collagen Ⅰ和α-SMA蛋白相對表達(dá)量顯著降低,E-cadherin顯著升高(P<0.05,見圖4)。

2.3 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響

與正常對照組比較,TGF-β1+si-NC組腹膜間皮細(xì)胞中p-Smad3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),Acetyl α-tubulin顯著降低(P<0.05);與TGF-β1+si-NC組比較,TGF-β1+si-PAI-1組腹膜間皮細(xì)胞中p-Smad3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),Acetyl α-tubulin顯著升高(P<0.05)。三組間Smad3蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。

與正常對照組比較,*P<0.05圖2 TGF-β1對腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1蛋白表達(dá)的影響Figure 2 The effect of TGF-β1 on the expression of PAI-1 protein in peritoneal mesothelial cells

與正常對照組比較,*P<0.05圖3 腹膜間皮細(xì)胞中si-PAI-1的轉(zhuǎn)染效率Figure 3 Transfection efficacy of si-PAI-1 in peritoneal mesothelial cells

2.4 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中EGFR/STAT3信號(hào)通路的影響

與正常對照組比較,TGF-β1+si-NC組腹膜間皮細(xì)胞中p-EGFR和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與TGF-β1+si-NC組比較,TGF-β1+si-PAI-1組腹膜間皮細(xì)胞中p-EGFR和p-STAT3蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。三組間EGFR和STAT3蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖6)。

與正常對照組比較,*P<0.05;與TGF-β1+si-NC組比較,#P<0.05圖4 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中PAI-1、Collagen Ⅰ、E-cadherin和α-SMA蛋白表達(dá)的影響Figure 4 The effects of PAI-1 on the expression of PAI-1, Collagen Ⅰ, E-cadherin and α-SMA protein in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

與正常對照組比較,*P<0.05;與TGF-β1+si-NC組比較,#P<0.05圖5 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響Figure 5 The effects of PAI-1 on the TGF-β1/Smad3 signaling pathway in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

與正常對照組比較,*P<0.05;與TGF-β1+si-NC組比較,#P<0.05圖6 PAI-1對TGF-β1誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞中EGFR/STAT3信號(hào)通路的影響Figure 6 The effects of PAI-1 on the EGFR/STAT3 signaling pathway in peritoneal mesothelial cells induced by TGF-β1

2.5 PAI-1對高糖透析液誘導(dǎo)的腹膜纖維化小鼠腹膜纖維化的影響

HE染色和Masson三色染色結(jié)果顯示,與正常對照組比較,PE+si-NC組腹膜組織厚度、炎性細(xì)胞浸潤和ECM沉積明顯增加;與PE+si-NC組比較,PE+si-PAI-1組的上述病理變化明顯減輕(見圖7)。

圖7 小鼠腹膜組織的HE染色和Masson三色染色 (×200)Figure 7 HE staining and Masson trichrome staining of mouse peritoneal tissue (×200)

免疫組化染色結(jié)果顯示,與正常對照組比較,PE+si-NC組腹膜組織的E-cadherin陽性率顯著降低,α-SMA顯著增加(P<0.05,見圖7);與PE+si-NC組比較,PE+si-PAI-1組腹膜組織的E-cadherin陽性率顯著增加,α-SMA顯著降低(P<0.05,見圖8)。

與正常對照組比較,*P<0.05;與PE+si-NC組比較,#P<0.05圖8 小鼠腹膜組織E-cadherin和α-SMA的免疫組化染色 (×200)Figure 8 Immunohistochemical staining of E-cadherin and α-SMA in mouse peritoneal tissue (×200)

3 討論

多項(xiàng)研究報(bào)道了PAI-1在肺、肝、腎、心臟和血管纖維化中的作用。PAI-1的表達(dá)在人纖維化肺和博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺中均升高[18]。PAI-1對肺纖維化的刺激作用的一個(gè)可信的解釋是,它通過抑制纖溶酶的生成,進(jìn)而促進(jìn)過量的纖維蛋白積累。Bergheim等[19]報(bào)道,PAI-1缺陷型小鼠的膽管結(jié)扎引起的早期肝損傷和炎癥明顯減弱。Wang等[20]證明,與野生型小鼠相比,PAI-1缺陷型小鼠肝臟纖維化減少,tPA和MMP9活性增加。PAI-1在正常腎臟中低水平表達(dá),但在幾種急性和慢性腎臟疾病中均高水平表達(dá)[21]。PAI-1被證明可以通過減少間質(zhì)性成肌纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量來預(yù)防單側(cè)輸尿管梗阻介導(dǎo)的腎纖維化[22]。PAI-1缺乏也會(huì)減弱腎臟中的間質(zhì)膠原沉積[23]。以前的研究已經(jīng)證明,心肌梗死后心肌細(xì)胞中PAI-1表達(dá)的增加有助于心肌纖維化的進(jìn)展。在心肌梗死模型中,PAI-1缺乏與較少的心臟纖維化有關(guān)[24]。然而,目前缺乏PAI-1在腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化方面的研究。

腹膜纖維化是長期腹膜透析患者發(fā)生的主要并發(fā)癥之一,其特點(diǎn)是肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增加和間質(zhì)ECM沉積。大多數(shù)體外和體內(nèi)研究都支持受損的間皮細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞的來源。在腹膜纖維化過程中,大約17%的肌成纖維細(xì)胞來源于間皮細(xì)胞,受損的間皮細(xì)胞獲得了產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和生長因子的能力,這些因子可以刺激常駐成纖維細(xì)胞的激活和增殖,從而產(chǎn)生更多的ECM蛋白,促進(jìn)腹膜纖維化的發(fā)展[25]。抑制EMT或局部成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化可能會(huì)減緩腎纖維化的發(fā)展,因?yàn)殚g皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞都能產(chǎn)生Collagen Ⅰ,Collagen Ⅰ是ECM的主要成分,本研究結(jié)果表明與未進(jìn)行腹膜透析的患者相比,腹膜透析后PAI-1被激活。PAI-1的激活在腹膜間皮細(xì)胞的EMT和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化過程中起著至關(guān)重要的作用。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默PAI-1后,TGF-β1誘導(dǎo)的間皮細(xì)胞中E-cadherin(上皮細(xì)胞標(biāo)志物)明顯下調(diào),而α-SMA和Collagen Ⅰ(間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志)明顯上調(diào),從而抑制了EMT過程及隨后的纖維化。

本研究結(jié)果顯示,下調(diào)PAI-1可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的間皮細(xì)胞Smad-3的磷酸化,通過阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路來預(yù)防腹膜纖維化。目前,PAI-1如何促進(jìn)TGF-β1/Smad信號(hào)的激活仍不清楚。以前的研究表明,腹膜損傷是由Smad-3依賴機(jī)制介導(dǎo)的[26]。Smads與微管的結(jié)合使Smads處于非活躍期,TGF-β1可以觸發(fā)Smads從微管釋放并隨后磷酸化[27]。因此,PAI-1對Acetyl α-tubulin的脫乙酰化可能改變微管功能,影響Smad磷酸化。本研究中PAI-1對Acetyl α-tubulin的上調(diào)也證實(shí)了這一推論。

間皮細(xì)胞可能通過產(chǎn)生EGF和CTGF促進(jìn)腹膜纖維化。這些生長因子以旁分泌方式靶向間皮,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[28]。抑制PAI-1也可能通過靶向EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而減輕腹膜纖維化。最近的研究表明,EGFR是腎和腹膜纖維化的關(guān)鍵介質(zhì)[6]。在本研究中,抑制PAI-1導(dǎo)致培養(yǎng)的間皮細(xì)胞中EGFR的磷酸化水平降低。抑制PAI-1也降低了EGFR下游分子STAT3的磷酸化。其他人的研究已經(jīng)證明EGFR/STAT3通路的激活與腹膜纖維化的進(jìn)展有關(guān)[29]。另外,本研究證明了下調(diào)PAI-1抑制了STAT3的磷酸化,這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對各種炎性細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)和產(chǎn)生至關(guān)重要[30]。腹膜纖維化炎癥的特征是細(xì)胞因子/趨化因子的大量表達(dá)和巨噬細(xì)胞的浸潤[31]。PAI-1可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控這些細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá),從而減輕纖維化。

綜上所述,本研究首次在體內(nèi)外研究中證明了下調(diào)PAI-1可抑制腹膜纖維化的發(fā)展,推測這種抗纖維化機(jī)制可能與TGF-β1/Smad3和EGFR/STAT3信號(hào)通路的失活有關(guān)。然而,在接下來的研究中還需要進(jìn)行信號(hào)通路的阻斷/增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一推論。總之,PAI-1可能是預(yù)防和治療腹膜纖維化的潛在靶標(biāo)。