周興華,龔道銀,鐘 森

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科,成都 610072;2成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科;3成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院感染科;*通訊作者,E-mail:zhongsen6606@163.com)

茵陳蒿湯始載于《傷寒雜病論·黃疸篇》,是治療濕熱黃疸的經(jīng)方,本方由茵陳蒿、梔子、大黃三味藥組成,方中用茵陳蒿清熱利濕退黃;梔子清解三焦邪熱;大黃泄熱通便,兼顧活血化瘀,諸藥共湊清熱利濕退黃之效[1-3]。導(dǎo)師鐘森在前人基礎(chǔ)上結(jié)合自己多年臨床經(jīng)驗(yàn),將唐代藥王孫思邈《千金藥方·黃疸》中的茵陳蒿湯靈活運(yùn)用于實(shí)踐,療效顯著。已有研究表明TLRs/核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信號通路廣泛參與肝損傷的病理過程,TLR4、MyD88、p-NF-κB及TNF-α蛋白是TLRs/NF-κB信號通路中的關(guān)鍵蛋白[4,5]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用D-氨基半乳糖誘導(dǎo)急性肝損傷模型,觀察TLR4、MyD88、p-NF-κB及TNF-α蛋白表達(dá)的變化,并探討加味茵陳蒿湯對急性肝損傷大鼠的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SD雌性大鼠,SPF級,42只,體質(zhì)量180-220 g,由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(川)2008-24。飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院屏障級實(shí)驗(yàn)動物中心,食用統(tǒng)一購制標(biāo)準(zhǔn)丸狀飼料,飲自來水,室溫15-20 ℃,相對濕度60%-80%的實(shí)驗(yàn)室。

1.2 肝臟損傷模型的構(gòu)建及分組

實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。除空白組外，其余各組大鼠腹腔一次性注射D-GaIN(700 mg/kg)/LPS(10 μg/kg)以造成急性肝損傷模型。大鼠按體質(zhì)量用隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，每組6只，分別為：①模型組：灌胃等體積生理鹽水，2次/d，連續(xù)給藥2周；②西藥組：灌胃復(fù)方甘草酸苷15.75 mg/kg，2次/d，連續(xù)給藥2周；③中藥組：灌胃加味茵陳蒿湯58.8 g/kg，2次/d，連續(xù)給藥2周；④空白組：灌胃等體積生理鹽水，2次/d，連續(xù)給藥2周；⑤TLR4過表達(dá)組：造模后靜脈注射0.5 ml腺病毒包裝的TLR4過表達(dá)載體(pDC-TLR4,1×1011PFU)，1次/周，連續(xù)給藥2周；⑥西藥+TLR4過表達(dá)組：大鼠靜脈注射pDC-TLR4 0.5 ml，1次/周，之后灌胃復(fù)方甘草酸苷15.75 mg/kg，2次/d，連續(xù)給藥2周；⑦中藥+TLR4過表達(dá)組：大鼠靜脈注射pDC-TLR4 0.5 ml，1次/周，之后灌胃加味茵陳蒿湯58.8 g/kg，2次/d，連續(xù)給藥2周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠股動脈放血處死動物，迅速剖取大鼠肝臟，將其置于冰盤上，于生理鹽水中洗凈血跡后，裝于DEPC水處理過的EP管中，放置液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.3 受試藥物

加味茵陳蒿湯處方:茵陳30 g,梔子30 g,酒大黃15 g,黃連15 g,黃芩15 g,黃芪30 g,赤芍30 g,藥材均來自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院名醫(yī)堂,由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室制備。復(fù)方甘草酸苷片(批號20191014,日本米諾發(fā)源制藥株式會社山片劑株式會社)。

1.4 試劑和儀器

ALT及AST試劑盒:中生北控生物科技股份有限公司(批號:090302,090273);D-GalN(純度>99%,Sigma公司,批號1772-03-9),臨用前用生理鹽水配置成10%的溶液,用1 mmol/L NaOH調(diào)pH至7.0;腺病毒包裝的TLR4過表達(dá)載體(pDC-TLR4,1×1011PFU);BS-600L電子天平(上海友聲衡器有限公司);PIKORed96 RT-PCR擴(kuò)增儀(美國ThermoFisher儀器有限公司);DY89-I型勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);UK-33型垂直電泳槽(美國Bio-RAD公司);UV Transilluminator化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 大鼠血清ALT、AST水平的測定 大鼠血清中ALT和AST的測定采用酶動力學(xué)法,由全自動生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.5.2 HE染色檢測大鼠肝臟組織的病理狀態(tài) 各組大鼠肝臟組織,用10%中性甲醛溶液固定、梯度乙醇(50%-100%)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,制成5 μm厚切片。將切片在二甲苯中脫蠟后,采用蘇木精-伊紅(HE)染色,脫水,中性樹脂封片。在高倍顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.5.3 Western blot分析TNF-α、MyD88、p-NF-κB及TLR4的表達(dá)水平 用RIPA裂解液各組大鼠肝臟組織,提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度,10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h,隨后按照適當(dāng)比例加入一抗(兔單抗TNF-α(#ab183218,Abcam,1 ∶1 000)、兔單抗MyD88(#ab183218,Abcam,1 ∶1 000)、兔單抗p-NF-κB(phospho S536,#ab76302,Abcam,1 ∶1 000)及TLR4(#ab22048,Abcam,1 ∶1 000)于4 ℃封閉過夜,第2天加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h,最后滴ECL進(jìn)行曝光,曝光顯色后的蛋白,Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin(#BM0627,Boster,1 ∶1 000)為內(nèi)參,計(jì)算各組蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST檢測結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠血清ALT、AST含量顯著升高(P<0.01);與模型組比較,中藥組和西藥組大鼠血清ALT、AST含量均有顯著降低(P<0.01);另外,與模型組相比,TLR4過表達(dá)組大鼠血清ALT、AST含量均有升高趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與西藥組相比,西藥+TLR4過表達(dá)組顯著逆轉(zhuǎn)了西藥對大鼠血清ALT、AST含量的下調(diào)作用(P<0.01);與中藥組相比,中藥+TLR4過表達(dá)組顯著阻止了中藥對大鼠血清ALT、AST含量的下調(diào)作用(P<0.01,見圖1)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥組比較,△△P<0.01;與中藥組比較,&&P<0.01圖1 各組大鼠血清ALT、AST水平Figure 1 The levels of ALT and AST in serum of rats in each group

2.2 各組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4蛋白表達(dá)的結(jié)果

與空白組比較,模型組大鼠肝組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,中藥組和西藥組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4含量均有顯著降低(P<0.01)。另外,與模型組相比,TLR4過表達(dá)組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4水平均顯著升高(P<0.01);與西藥組相比,西藥+TLR4過表達(dá)組顯著促進(jìn)了大鼠肝臟組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88和TLR4的表達(dá)(P<0.01);與中藥組相比,中藥+TLR4過表達(dá)組顯著增強(qiáng)了大鼠肝臟組織中TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4的表達(dá)水平(P<0.01,見圖2)。

與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥組比較,△△P<0.01;與中藥組比較,&&P<0.01圖2 各組大鼠肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88、TLR4蛋白表達(dá)的結(jié)果Figure 2 Expression of TNF-α, p-NF-κB, MyD88, TLR4 in liver tissues of rats in each group

2.3 肝臟病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠肝細(xì)胞呈彌漫性大片狀壞死,肝竇結(jié)構(gòu)被破壞,中央靜脈和匯管區(qū)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,說明造模成功;與模型組比較,中藥組和西藥組肝細(xì)胞壞死均有改善;其次,與模型組相比,TLR4過表達(dá)組大鼠肝組織炎性癥狀有加重的趨勢,肝細(xì)胞呈彌漫性大片狀壞死;與中藥組和西藥組相比,中藥+TLR4過表達(dá)組和西藥+TLR4過表達(dá)組均加劇了大鼠肝臟組織的炎性細(xì)胞浸潤情況(見圖3)。

圖3 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化Figure 3 Histopathological changes of liver tissues in rats in each group

3 討論

中藥在肝損傷的治療中具有廣闊的研究前景,中藥活性單體和復(fù)方制劑均能通過調(diào)節(jié)免疫、提高抗氧化能力和降低炎癥等,維護(hù)肝細(xì)胞正常功能的發(fā)揮并減緩肝細(xì)胞凋亡。報(bào)道顯示,加味茵陳蒿湯對肝炎、肝硬化、肝動脈栓塞等肝臟疾病的治療上具有顯著成效。加味茵陳蒿湯聯(lián)合熊去氧膽酸可用于臨床治療原發(fā)性膽汁性肝硬化,并顯著改善患者的肝功能[6]。另外,加味茵陳蒿湯聯(lián)合阿德福韋酯在慢性乙型肝炎早期可緩解患者肝臟功能異常和黃疸[7]。本實(shí)驗(yàn)利用急性肝損傷大鼠模型,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)加味茵陳蒿湯可顯著改善大鼠肝臟功能,并顯著緩解肝臟組織的受損程度和炎性細(xì)胞浸潤。

TLRs是近年天然免疫系統(tǒng)熱點(diǎn)研究的一個(gè)受體家族[8],不僅在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用,也參與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。TLRs廣泛表達(dá)在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞上,通過門靜脈接觸大量病原體成分,與各種病原微生物分子結(jié)合,通過信號傳導(dǎo)激活各種免疫細(xì)胞,參與肝臟的生理病理過程[9-11]。MyD88是含有TLR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白,屬于TLR信號通路中的下游信號分子,MyD88的磷酸化激活可以激活下游NF-κB分子的磷酸化[12,13]。TLR4/NF-κB信號通路活化后可合成大量TNF家族的炎癥因子,且這些因子均被證實(shí)與肝臟損傷密切相關(guān)。Bohgaki等[14]報(bào)道TLRs信號通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)和NF-κB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,介導(dǎo)MIP-2、TNF-α和IFN-r等炎癥因子生成,加重肝損傷的程度。另有研究發(fā)現(xiàn),漆黃素通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路減輕大鼠肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[15]。此外,毒消肝清丸可降低肝硬化內(nèi)毒素血癥大鼠肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及其mRNA的表達(dá),最終對大鼠肝臟炎性損傷起到緩解作用[16]。白藜蘆醇能顯著減輕H/R誘導(dǎo)的BRL-3A肝細(xì)胞損傷,該保護(hù)作用可能與白藜蘆醇抑制TLR4/NF-κB信號通路傳導(dǎo)有關(guān)[17]。因此,通過藥物處理降低TLR4/NF-κB信號通路的活性是改善肝損傷的有效策略。與前人研究結(jié)果類似,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加味茵陳蒿湯可顯著下調(diào)肝組織TNF-α、p-NF-κB、MyD88及TLR4的蛋白表達(dá),另外,TLR4的過表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了加味茵陳蒿湯對大鼠肝損傷的改善作用。該研究結(jié)果提示加味茵陳蒿湯可能通過調(diào)節(jié)大鼠肝組織中TLR4信號通路,避免其下游通路NF-κB的活化,進(jìn)而減少炎癥因子的釋放,從而減輕肝臟炎癥損傷。

綜上所述,加味茵陳蒿湯可以成功抑制D-GaIN刺激的大鼠急性肝臟功能損傷和肝臟細(xì)胞炎癥,其重要的作用機(jī)制之一是降低了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活性,本研究為急性肝損傷的治療提供了新的策略。