徐志強,李 晗

(1冀中能源峰峰集團有限公司總醫(yī)院骨五科,邯鄲 056200;2河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨三科;*通訊作者,E-mail:723119356@qq.com)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)為中老年人常見病癥,以關(guān)節(jié)軟骨退變、丟失為主要特點,關(guān)節(jié)腫痛、僵硬、畸形及活動受限為臨床特征的關(guān)節(jié)炎性疾病[1]。OA發(fā)病率較高、發(fā)病機制復(fù)雜,目前認為炎癥反應(yīng)是OA的關(guān)鍵致病因素之一[2]。細胞周期蛋白依賴性激酶7(cyclin dependent kinase 7,CDK7)可在OA軟骨中高表達,并通過促進轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路活化來參與OA軟骨炎癥反應(yīng)病理過程[3]。因此通過某種途徑抑制CDK7表達來阻斷NF-κB活化,可能對治療OA有一定價值。近來研究發(fā)現(xiàn),miR-210可通過NF-κB途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細胞存活、免疫應(yīng)答等生理過程[4],并參與牙周炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等病理過程[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-210可能對OA軟骨細胞炎癥及凋亡有保護作用[6],但其具體作用機制還不甚明確。本研究用生物信息學(xué)軟件(starbase)檢測到miR-210與CDK7有靶向調(diào)控作用,并推測,miR-210可能通過靶向作用于CDK7緩解OA炎癥損傷,這可能是治療OA的新思路。故本研究建立OA大鼠模型及人體外OA模型,給予miR-210激動劑進行治療,以期闡明OA病理過程中的分子生物學(xué)機制,為臨床治療OA提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級(SPF)同遺傳背景SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量200-220 g,6-7周育齡,購自于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部[SCXK(京)2016-0018]。所有大鼠于本院動物房中飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件:自然光照,自由飲食、飲水,溫度25 ℃,相對濕度50%。實驗遵循動物保護3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器 miR-210激動劑(Ago-miR-210,貨號:saier-m12,購自天津賽兒生物科技有限公);CDK7干擾劑(貨號:M00108,購自北京百奧萊科技有限公司);人SW1353軟骨細胞系(貨號:ZQ0404,購自上海中喬新舟生物科技有限公司);HE染色試劑盒(貨號E677218-0200,購自上海生物公司);U6 snRNA的正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-210正向引物為5′-GGGGGCGGAGAGGAGGAC-3′,反向引物為5′-AGATCAGCCGCTGTCACAC-3′;各引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Trizol試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號分別為15596026、4366597,均購自美國BD公司);CDK7、核因子-κB活性因子p65(NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等抗體(貨號分別為:ab256787、ab16502、ab239882、ab208113、ab66579,購自美國abcam公司);BCA蛋白定量試劑盒和胰蛋白酶(貨號分別為P0768,P0231,均購自美國Pierce公司)。手動輪轉(zhuǎn)式切片機(型號RM2125RTS,德國Leica公司);光學(xué)顯微鏡(型號SMZ745,日本尼康公司);蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(型號1659001、Trans-Blot SD,美國Bio-Rad公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠OA模型建立及分組給藥 取SD大鼠40只,隨機分為正常對照組、模型組、AgomiR-210組(注射miR-210激動劑,2 nmol/只)、AgomiR-210 NC組(注射miR-210陰性對照試劑,2 nmol/只),每組10只;除正常對照組外,其余各組均參照文獻[7]建立大鼠OA模型。取大鼠,用戊巴比妥鈉麻醉后,碘酒消毒后,在右膝髕骨內(nèi)側(cè)縱形切長約2.5 cm切口,將髕骨推向外側(cè)使其脫位,盡可能屈曲膝關(guān)節(jié)顯露關(guān)節(jié)腔,暴露交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板,用眼科剪剪斷前交叉韌帶,并切除內(nèi)側(cè)半月板。做抽屜試驗,若脛骨前移為陽性預(yù)示手術(shù)成功,立即縫合切口,包扎并固定,放回飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng),使其自由攝取食物和水。術(shù)后每天給予大鼠肌肉注射青霉素鈉(800 U/ml),連續(xù)3 d。正常對照組除只暴露交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板但不切除外,其余操作同模型組。于術(shù)后7 d開始給藥,AgomiR-210組參照文獻[8]設(shè)置給藥劑量并用生理鹽水稀釋為20 nmol/ml的溶液,經(jīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥0.1 ml;正常對照組及模型組經(jīng)關(guān)節(jié)腔注射0.1 ml生理鹽水;AgomiR-210陰性對照(AgomiR-210 NC)組將AgomiR-210 NC試劑用生理鹽水稀釋成20 nmol/ml的溶液,經(jīng)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.1 ml,各組大鼠均連續(xù)給藥8周,1次/d。

1.2.2 標本采集及軟骨病變大體觀察 各組大鼠均于末次給藥12 h后麻醉處死,解剖膝關(guān)節(jié),觀察內(nèi)側(cè)脛骨平臺關(guān)節(jié)面的病理改變,隨機取5只大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織標本置于4%多聚甲醛中固定24 h備用,剩余5只大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織標本迅速置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 膝關(guān)節(jié)HE染色觀察軟骨組織病理變化 取1.2.2標本采集項下多聚甲醛固定的膝關(guān)節(jié)軟骨組織,10%乙二胺四乙酸脫鈣1周、30%蔗糖溶液脫水、石蠟包埋切片,并按HE試劑盒說明書進行染色,光鏡下觀察組織形態(tài)。參照文獻[9]由3名檢查者采用改良Mankin’s評分評估軟骨破壞的嚴重程度。

1.2.4 Western blot法檢測軟骨組織CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達 取1.2.2標本采集項下-80 ℃保存膝關(guān)節(jié)軟骨組織,于4 ℃冰箱中解凍后,取出軟骨,剪碎研磨,加入200 μl蛋白裂解液,用勻漿儀器完全勻漿后,12 000 r/min離心5 min,取上清液,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白總濃度。取50 μg蛋白上樣,進行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng),TBST溶液清洗后,加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h,TBST溶液清洗3次后,加入一抗(CDK7、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α、β-actin)抗體,除內(nèi)參抗體稀釋倍數(shù)為1 ∶1 000,其余抗體稀釋倍數(shù)均為1 ∶500),4 ℃搖床室溫孵育過夜,TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗(稀釋倍數(shù)1 ∶2 000),37 ℃搖床室溫孵育1 h,TBST清洗3次后,采用增強化學(xué)發(fā)光法顯色,以化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照,并以Image-J軟件分析各組蛋白相對表達。

1.2.5 qRT-PCR法檢測大鼠軟骨組織miR-210 取1.2.2中-80 ℃保存的軟骨組織,于4 ℃條件下解凍后,用組織勻漿器勻漿離心分離后,取上清液,用Trizol試劑盒提取總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。將cDNA稀釋10倍,加入cDNA 4 μl,正向引物、反向引物各0.4 μl,進行qRT-PCR反應(yīng)。miR-210以U6為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt算法計算miR-210相對表達量。

1.2.6 雙熒光素酶報告試驗驗證miR-210與CDK7的靶向關(guān)系 將人SW1353軟骨細胞分成miR-210 NC+CDK7-3′UTR-WT組、miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-WT組、miR-210 NC+CDK7-3′UTR-MUT組、miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-MUT組。miR-210 NC+CDK7-3′UTR-WT組:合成CDK7 mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)的miR-210識別序列,克隆至螢火蟲熒光素酶載體質(zhì)粒(pmiR-Report)載體中,得到pmiRGlo-CDK7 3′UTR-WT后與miR-210 NC共轉(zhuǎn)染。miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-WT組:pmiRGlo-CDK7 3′UTR-WT質(zhì)粒與miR-210 mimics共轉(zhuǎn)染。miR-210 NC+CDK7-3′UTR-MUT組:pmiRGlo-CDK7-3′UTR-MUT質(zhì)粒與miR-210 NC共轉(zhuǎn)染。miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-MUT組:pmiRGlo-CDK7-3′UTR-MUT質(zhì)粒與miR-210 mimics共轉(zhuǎn)染。各組分別于轉(zhuǎn)染48 h后,檢測螢火蟲熒光活性/海參熒光活性。

1.2.7 建立人SW1353軟骨細胞OA模型并檢測相關(guān)基因蛋白表達 復(fù)蘇培養(yǎng)人SW1353軟骨細胞,分成正常組、OA模型組(10 ng/ml IL-1β誘導(dǎo)建立OA模型)、miR-210 mimic組(轉(zhuǎn)染miR-210過表達試劑)、miR-210 mimic NC組(轉(zhuǎn)染miR-210過表達陰性對照試劑)、miR-210 mimic+pcDNA-CDK7(轉(zhuǎn)染miR-210過表達試劑及CDK7過表達序列)、miR-210 mimic+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-210過表達試劑+CDK7過表達陰性對照序列)。正常組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;OA模型組:含10 ng/ml IL-1β培養(yǎng)基培養(yǎng)人SW1353軟骨細胞24 h建立OA細胞模型;其余各組均運用轉(zhuǎn)染試劑盒將miR-210 mimic、miR-210 mimic NC、miR-210 mimic+pcDNA-CDK7、miR-210 mimic+pcDNA轉(zhuǎn)染后建立OA細胞模型。OA細胞模型誘導(dǎo)成功24 h后,提取各組細胞蛋白及總RNA按1.2.4及1.2.5方法檢測CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白及miR-210表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 過表達miR-210對OA大鼠軟骨組織miR-210及CDK7蛋白表達的影響

與正常對照組相比,模型組及AgomiR-210 NC組大鼠軟骨組織CDK7蛋白表達升高(P<0.05),miR-210表達降低(P<0.05)。與模型組及Ago-miR-210 NC組相比,AgomiR-210組大鼠軟骨組織,CDK7蛋白表達降低(P<0.05),miR-210表達升高(P<0.05)。AgomiR-210 NC組大鼠上述指標與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖1,表1)。

表1 miR-210、CDK7在OA大鼠軟骨組織中表達水平

1.正常對照組;2.模型組;3.AgomiR-210組;4.AgomiR-210 NC組圖1 各組大鼠CDK7蛋白表達免疫印跡圖Figure 1 Expression of CDK7 protein in rats in each group by immunoblotting

2.2 過表達miR-210對OA大鼠膝關(guān)節(jié)病變程度的影響

正常對照組大鼠膝關(guān)節(jié)面完整,色澤正常。模型組、AgomiR-210 NC組大鼠膝關(guān)節(jié)面糜爛、潰瘍、剝落較多,軟骨缺損深入軟骨表中層,部分缺損達軟骨深層,部分軟骨下骨暴露明顯。AgomiR-210組大鼠膝關(guān)節(jié)面未見剝落、潰瘍,極少部分出現(xiàn)糜爛,大部分色澤正常,軟骨缺損較少。

2.3 過表達miR-210對OA大鼠膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)及Mankin’s評分的影響

正常對照組大鼠軟骨基質(zhì)著色均勻,軟骨層細胞排列正常、潮線清楚。模型組及AgomiR-210 NC組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,軟骨層破壞明顯,深達軟骨下骨層,骨缺損明顯,潮線周圍微小血管形成較多,Mankin’s評分高于正常對照組(P<0.05，見圖2，3)。AgomiR-210組大鼠軟骨表層較平整,有細小缺損,軟骨細胞輕度減少,潮線模糊,表層軟骨基質(zhì)著色輕度變淺,Mankin’s評分低于正常對照組及AgomiR-210 NC組(P<0.05)。AgomiR-210 NC組大鼠軟骨病理損傷程度及Mankin’s評分與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2,3)。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織HE染色結(jié)果 (×200)Figure 2 HE staining of rat knee tissues in each group (×200)

2.4 過表達miR-210對OA大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達的影響

與正常對照組相比,模型組及AgomiR-210 NC組大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達升高(P<0.05);與模型組及AgomiR-210 NC組相比,AgomiR-210組大鼠軟骨組織p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達降低(P<0.05);AgomiR-210 NC組大鼠上述指標與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖4,表2)。

表2 各組大鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達水平比較

與正常對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與AgomiR-210 NC組相比,cP<0.05圖3 軟骨組織病理損傷Mankin’s評分Figure 3 Mankin’s score of pathological damage of cartilage tissue

1.正常對照組;2.模型組;3.AgomiR-210組;4.AgomiR-210 NC組圖4 各組大鼠p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達免疫印跡圖Figure 4 Protein expression of p-NF-κB p65/NF-κB p65,IL-6,TNF-α in rats in each group by Western blot

2.5 miR-210與CDK7靶向關(guān)系驗證

miRtarbase預(yù)測顯示,miR-210與CDK7 mRNA的3′UTR有結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因檢測顯示,與miR-210 NC+CDK7-3′UTR-WT組比較,miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-WT組熒光素酶活性降低(P<0.05),miR-210 NC+CDK7-3′UTR-MUT組和miR-210 mimics+CDK7-3′UTR-MUT組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖5、表3)。

圖5 miRtarbase預(yù)測CDK7為miR-210靶基因Figure 5 Mirtarbase predicted Cdk7 as a mir-210 target gene

表3 各組細胞熒光素酶活性檢測結(jié)果

2.6 過表達miR-210和CDK7對人軟骨細胞炎癥相關(guān)蛋白表達的影響

與正常組相比,OA模型組及miR-210 mimic NC組細胞miR-210表達降低(P<0.05),CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達升高(P<0.05)。與OA模型組及miR-210 mimic NC組相比,miR-210 mimic+pcDNA-CDK7組細胞miR-210表達升高(P<0.05),CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達差異不顯著(P>0.05);miR-210 mimic組及miR-210 mimic+pcDNA組細胞miR-210表達升高(P<0.05),CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達降低(P<0.05)。與miR-210 mimic+pcDNA-CDK7組相比,與miR-210 mimic組及miR-210 mimic+pcDNA組細胞miR-210表達差異不顯著(P>0.05),CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達降低(P<0.05)。miR-210 mimic NC組與OA組相比,miR-210 mimic組與miR-210 mimic+pcDNA組相比,上述指標變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見表4，圖6)。

表4 各組細胞中miR-210、CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α表達水平比較

1.正常組;2.OA模型組;3.miR-210 mimic組;4.miR-210 mimic+pcDNA組;5.miR-210 mimic+pcDNA-CDK7組;6.miR-210 mimic NC組圖6 軟骨細胞中CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達免疫印跡圖Figure 6 Protein expression of CDK7, p-NF-κB p65/NF-κB p65, IL-6, TNF in chondrocytes by Western blot

3 討論

OA是關(guān)節(jié)最常見疾病,關(guān)節(jié)軟骨進行性破壞及軟骨下骨硬化是OA主要病理特征[10]。橫斷前交叉韌帶和切除內(nèi)側(cè)半月板造模方法可引起軟骨表面完整性缺失、軟骨表層基質(zhì)塌陷、光澤度消失等軟骨結(jié)構(gòu)的改變,是臨床公認的OA造模方法[11]。本研采用上述方法建模發(fā)現(xiàn),模型組大鼠膝關(guān)節(jié)面糜爛、潰瘍、剝落及軟骨缺損嚴重,部分軟骨下骨暴露明顯,關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙,軟骨層破壞深達軟骨下骨層,潮線周圍微小血管形成較多,且軟骨破壞程度Mankin’s評分明顯高于正常對照組,提示模型組大鼠軟骨結(jié)構(gòu)受到明顯破壞,表明造模成功。另外,OA軟骨退變與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[12],軟骨及滑膜細胞分泌的促炎因子IL-6等會加重關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng),促進關(guān)節(jié)軟骨損傷[13]。近來研究發(fā)現(xiàn)敲除CDK7基因可有效抑制NF-κB信號通路的激活及p65核移位,降低炎癥因子IL-6、TNF-α轉(zhuǎn)錄及表達[14],且體內(nèi)外研究實驗均證實CDK7可在人軟骨中表達并參與骨關(guān)節(jié)炎及軟骨炎癥反應(yīng)過程[3,14]。本研究發(fā)現(xiàn)OA大鼠軟骨組織中CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平均高于正常對照組,miR210低于正常對照組,提示CDK7介導(dǎo)的NF-κB炎癥激活,可能參與OA大鼠軟骨病變過程。

OA治療方法多種多樣,但目前仍無有效的根治OA方法[15]。近年研究表明microRNA分子在OA發(fā)生、發(fā)展過程中起主導(dǎo)作用,miRNA可作為治療的靶點用于OA治療的觀點也越來越多[16]。研究證實microRNA可以序列互補方式直接抑制靶mRNA翻譯或促進其轉(zhuǎn)錄物的降解,參與調(diào)控軟骨細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等過程[17]。miR-210已被證實是促炎細胞因子產(chǎn)生的抑制劑[18]。Li等[19]體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-210在OA軟骨細胞中表達水平明顯低于正常對照組,本研究結(jié)果顯示給予OA大鼠miR-210激動劑AgomiR-210進行治療后,發(fā)現(xiàn)AgomiR-210組大鼠膝關(guān)節(jié)面剝落、潰瘍及糜爛明顯緩解,軟骨結(jié)構(gòu)趨于正常,且Mankin’s評分、軟骨組織中CDK7、p-NF-κB p65/NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平均低于模型組,miR210高于模型組,推測關(guān)節(jié)腔外注射miR-210可能通過抑制CDK7介導(dǎo)的NF-κB通路激活,緩解OA炎癥損傷,表明過表達miR-210可能是治療OA病理損傷的途徑之一。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),CDK7為miR-210的靶基因,并經(jīng)雙熒光素酶報告試驗證實,推測miR-210對OA的治療作用可能與調(diào)控CDK7表達有關(guān)。

TNF-α誘導(dǎo)可引起人SW1353軟骨細胞中CDK7表達顯著增高,下調(diào)CDK7可顯著降低OA模型細胞中CDK7表達及NF-κB炎性通路活性[3,20]。本研究觀察到OA模型細胞中miR-210、CDK7及炎癥通路表達與動物模型軟骨組織中趨勢一致。轉(zhuǎn)染miR-210mimic后,發(fā)現(xiàn)與OA模型組相比,miR-210 mimic組細胞中CDK7及其相關(guān)炎癥因子表達明顯降低,與動物OA模型中趨勢一致,進一步證明過表達miR-210可抑制CDK7介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活。另外,同時轉(zhuǎn)染miR-210 mimic及CDK7過表達質(zhì)粒后,miR-210 mimic+pcDNA-CDK7組OA細胞中CDK7及其相關(guān)炎癥因子表達均高于miR-210 mimic組,提示CDK7過表達可逆轉(zhuǎn)miR-210對OA軟骨細胞炎癥通路激活的抑制作用,進一步表明Ago-miR-210抑制OA大鼠及軟骨細胞炎癥反應(yīng)的作用,可能通過靶向抑制CDK7表達實現(xiàn)。

綜上所述,miR-210可能通過靶向抑制CDK7表達及其介導(dǎo)的NF-κB信號通路活化,進而緩解OA炎癥損傷及軟骨病變。本研究從基因分子水平對OA軟骨病變機制進行初步探討,為關(guān)節(jié)內(nèi)注射miRNA治療OA提供了一定實驗參考,但動物實驗及人體內(nèi)外研究差異性較大,關(guān)節(jié)內(nèi)注射miR-210治療OA的應(yīng)用推廣,還有待后續(xù)驗證。